RNA干扰在肿瘤治疗中的靶点研究

袁慎俊，陈涛

(三峡大学医学院，湖北宜昌443002)

RNA干扰在肿瘤治疗中的靶点研究

袁慎俊，陈涛

(三峡大学医学院，湖北宜昌443002)

RNA干扰是一种转录后基因沉默机制。通过RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，进而为恶性肿瘤的治疗提供一种崭新的手段。本文就RNA干扰的机制、作用靶标及相关的临床应用做一综述。

RNA干扰；基因沉默；微小RNAs；长非编码RNAs；肿瘤治疗

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过小RNA分子调控基因表达的现象[1]。其靶点特异性比小分子药物更高，且不需要特殊的结合蛋白，可以直接作用于单克隆抗体无法到达的靶点，直接阻止某些基因翻译产生致病蛋白，在源头阻断疾病发生，从而避免了使用小分子药物或其他生物制剂在分子级联通路下游治疗疾病。肿瘤的发生是多个基因相互调控作用“失灵”的结果，当前对肿瘤的治疗主要是通过物理和化学的方法抑制DAN复制及细胞增殖，进而杀死癌细胞，然而这些方法不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长。而RNA干扰可以利用同一基因家族中多个成员具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可以使多个基因同时沉默，从而促使癌细胞生长停滞。

1 siRNA与RNA干扰

RNA干扰是一种基因转录后沉默机制，它由双链RNA(Doublestranded RNA，dsRNA)启动，在Dicer酶的参与下，把RNA分子切割为小分子干扰RNA(Small interfering RNA/shortinterfering RNA，siRNA)，并特异性地与mRNA的同源序列结合，从而产生相应的功能表型缺失的现象。RNA干扰技术实质是将siRNA通过不同方式导入到细胞或动物体内，将相应的目的基因沉默掉，进而使相应的功能表型缺失。在动植物体中，转录后基因沉默是通过dsRNA介导的，dsRNA在序列上与靶基因具有同源性。RNA干扰能够高效沉默具有调节特殊生理/病理通路功能的靶基因，并且能够在转录水平上通过siRNA下调靶mRNA[2]。有研究表明，人类疾病相关基因的过度表达将成为基于RNA干扰治疗的一个潜在靶点[3]。由于RNA干扰的高度特异性和低毒性，该技术已经成为基因功能和基因治疗方面的有效工具，并且可以治疗传统药物无法治愈的各种人类疾病，比如高胆固醇血症[4]、病毒性肝炎[5]、亨廷顿氏舞蹈症[6]。

在恶性肿瘤中，RNA干扰可以沉默由基因扩增、突变或者过表达而引发的癌基因。研究显示，在肿瘤治疗中，RNA干扰在细胞凋亡、自噬、肿瘤代谢和细胞衰老等方面取得了巨大成功[7]。目前，应用基于RNA干扰的基因沉默来治疗肿瘤已经有了实质性进展，并且正在进行中的药物临床试验有望替代传统的肿瘤化疗。

2 miRNAs作为RNA干扰的靶标

MicroRNA(miRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，由21～25个核苷酸组成。这些小的miRNAs通常靶向一个或者多个mRNAs，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。最近有研究表明，miRNAs与癌症有确切联系，它们在肿瘤发生中扮演着癌基因或者抑癌基因的角色。进一步的证据表明，miRNAs在肿瘤进展方面也起着重要作用，包括肿瘤血管生成[8]、转移[9-10]以及对干预治疗的反应性[11]。因此，鉴别具有致癌作用的miRNAs对肿瘤治疗有着深远影响。有报道显示抑制参与致癌作用的miRNAs可以阻断许多癌症相关的信号通路，如miR-21。Tomimaru等[12]证明转染了抗miR-21的肝癌细胞对IFN-α/5-Fu的化疗更加敏感了，而且在临床患者的肝癌标本中，miR-21的表达高低与患者对IFN-α/ 5-Fu联合治疗的反应性和生存率有关。又如，全身给予肝癌移植瘤小鼠具有抗miR-221同工修饰的胆固醇或者抗miR-221的寡核苷酸可以增加小鼠的生存周期和显著减少肿瘤结节的数目及大小[13-14]。在子宫内膜癌中，miR-let-7是下调的，并且Let-7 miRNAs与子宫内膜癌的发生高度相关。一项调查显示Let-7a在提升癌细胞的增殖方面能对抗Aurora-B的功能，并且是通过下调Aurora-B蛋白水平介导的[15]。Zhang等[16]证明miR-125b能通过调节抑癌基因Bak1的表达来促进急性早幼粒细胞白血病细胞的增殖和抑制细胞凋亡。miR-155的过量表达能够减少SMAD5的表达和诱导TGF-β对淋巴瘤的生长抑制[17]。Zhang等[18]构建质粒pSUPER-c-FLIP-siRNA并将其转染U2OS细胞，发现由于c-FLIP-siRNA的干扰细胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)的表达明显受到抑制。

除了miRNAs的多靶点受到调节外，其本身也可以受到体内其他因子的影响。例如转录因子E2F1可以通过激活miR-17-92的表达来促进各种肿瘤进展。反过来miR-17-92也可以通过调控E2F的平衡使促凋亡的E2F1表达和促增殖的E2F3表达[19]。Egger等[20]一项新发现表明，表观遗传变异比如DNA甲基化和组蛋白修饰，能够影响miRNAs的表达。例如，在5-Aza-CdR(一种DNA甲基化抑制剂)和苯基丁酸(一种组蛋白去乙酰酶抑制剂)治疗的肿瘤中，miR-127在肿瘤细胞中显著上调。Scott等用组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)抑制剂LAQ824处理乳腺癌细胞SKBr3，其miRNAs的转录受到明显抑制[21]。这些发现表明多种致癌性miRNAs和表观遗传学药物可以作为RNA干扰肿瘤治疗的潜在靶点。

3 lncRNAs作为RNA干扰的靶标

长非编码RNAs(Long noncoding RNAs，lncRNAs)是一组内源性、长度大于200个核苷酸、特异完整的开放阅读框和无蛋白质编码功能的RNA[22]。参与了一些生物过程如表观遗传调控[23-24]、细胞凋亡和细胞周期调控[25]、细胞发育和分化[26]、基因转录调节[22]。研究表明，在人类癌症中lncRNAs的失调是一个重要特征。最近，多种lncRNAs被认为在癌症的发生发展中扮演着关键作用[27-28]。因此，可以预见致癌性lncRNAs可用于癌症的诊断和预后判断，并且可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。目前，最常用的方法是利用RNA干扰来调节癌细胞的lncRNAs水平或功能。

肺腺癌转移相关转录子1(MALAT1)是一个长度大约8 000个核苷酸和位于染色体11q13上的核lncRNA，与肿瘤的转移和复发相关[29-30]。MALAT1能诱发各种肿瘤细胞的恶性潜能，并且这种作用可以通过抑制MALAT1得以逆转。在肺腺癌中，通过RNA干扰使MALAT1沉默来下调运动相关基因的表达从而破坏细胞的运动能力[31]。下调MALAT1也可以影响EMT相关基因的表达，从而减少ZEB1、ZEB2和Slug的水平，增加E钙黏附素的水平[30，32]。此外，低表达MALAT1的非小细胞肺癌细胞接种裸鼠可以影响肿瘤的形成和生长，并且高表达MALAT1的肺鳞癌预后不良[32]。

另一个属于lncRNAs子类的是HOX基因转录反义RNA(HOTAIR)，它是第一个与转移相关的lncRNAs。有临床研究显示：HOTAIR表达水平与多种肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等)的发生发展及转移预后密切相关。高表达HOTAIR能抑制抑癌基因的表达，促进肿瘤复发转移，而下调HOTAIR表达则降低肿瘤细胞的转移侵袭能力[33-34]。这些预示HOTAIR在癌症生物学中扮演着极其重要的角色和显示出了重要的临床意义。HOTAIR参与了多样生物过程造成的恶性表型，并且这种改变可以通过抑制HOTAIR得以逆转。乳腺癌中HOTAIR的高表达能够抑制细胞增殖和侵袭[35]。在癌细胞中HOTAIR能够通过抑制MMP-9和VEGF蛋白表达来减少细胞的运动和转移[36]。HOTAIR低表达的胰腺癌细胞在小鼠异种移植瘤模型中能够抑制肿瘤生长[33]。总之，大量的研究正在进一步明确lncRNAs的分子功能，基于RNA干扰lncRNAs的肿瘤治疗可能成为一种新的治疗方法。

4 RNA干扰的临床试验

基于RNA干扰的肿瘤治疗已经成为了一项新技术，正在以前所未有的速度应用到临床中。第一个基于RNA干扰的抗肿瘤药物CALAA-01(CALAA-01为RONDELTM注射配方与瞄准癌症治疗的siRNA序列)，它是一类由环糊精分子包裹而成的纳米颗粒，可以在实体瘤中累积，阻止其靶点RRM2(RRM2是核糖核酸酶的M2亚基，在细胞分裂过程中起重要作用)的翻译，从而抑制癌细胞分裂。静脉给药CALAA-01对肝癌、黑色素瘤和尤因肉瘤异种移植瘤小鼠有显著抗肿瘤效果，并且在非人灵长类动物中没有观察到肝毒性和免疫反应[37]。

由美国奥尼兰姆(Alnylam)生物技术公司开发的ALN-VSP02，借用脂质纳米颗粒包被两种针对VEGF和纺锤体驱动蛋白的siRNAs，通过沉默与肿瘤组织血管生成相关的生长因子的蛋白合成，来抑制肿瘤区血管的生成，达到将癌细胞“饿死”的效果。人体试验表明全身性递送siRNA能够减少肿瘤的肝内转移和增强肝癌化疗的敏感性，并且采用两周一次的静脉给药ALN-VSP是安全的和耐受性良好[38]。siRNA的脂质体复合物Atu027能够靶向蛋白激酶N3，全身给药时，能够显著抑制肿瘤生长及淋巴结或肺的转移，并且没有剂量依赖性毒性[39-40]。由稳定核酸脂质颗粒(SNALPs)制备的polo样激酶I(PLK1)[41]或VEGF的siRNA已经被开发用来评估基于RNA干扰治疗原发性肝癌或肝转移癌患者的安全性和有效性。这些临床试验表明，RNA干扰的发现不仅为抗癌药物的开发提供了快速和崭新的方法，而且也有可能成为治疗癌症的下一个新手段。

5 展望

RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗。对于癌症来说，RNA干扰或许可以成为一个强有力的武器，尤其是对于目前还没有靶向药物的致癌基因。以MYC为例，该基因同很多种癌症发生有关，但是目前还没有对抗这个基因的有效药物，RNA干扰则给研究者提供了一个有力工具，它不像小分子药物和生物制剂通过抑制突变蛋白来控制癌症，而是直接阻断蛋白产生过程。随着RNA干扰技术的不断研究深入及基础研究向临床应用的转化，相信在不久的将来，RNA干扰将成为肿瘤治疗的又一新手段。

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Application of RNA interference in cancer therapy.

YUAN Shen-jun,CHEN Tao.Medical College of Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

RNA interference(RNAi)is a post-transcriptional gene silencing.With RNAi technique,we can specially reject or shut off the expression of certain genes and thereby provide a new therapy for maligant tumors.In this paper,the mechanism of RNAi,the target and related clinical applications are reviewed.

RNAi;Gene silencing;miRNAs;lncRNAs;Cancer therapy

R730.5

A

1003—6350（2016）01—0085—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.030

2015-05-07)

国家自然科学基金(编号:81173612)

陈涛。E-mail：chentao@ctgu.edu.cn