微小RNA在卵巢上皮性肿瘤中诊断及治疗的研究进展

徐菲，钱莉莉，吴大保，周颖

微小RNA在卵巢上皮性肿瘤中诊断及治疗的研究进展

徐菲，钱莉莉，吴大保，周颖△

卵巢上皮性肿瘤（EOC）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，也是导致妇女癌症死亡的第五大病因。为了延长晚期EOC患者的生存期，克服化疗耐药是治疗的重要措施。微小RNA（miRNAs）能调控与耐药相关的多种基因，是化疗耐药的研究热点。多种miRNAs在EOC中异常表达，联合检测血浆中miR-205和let-7f可以提高EOCⅠ期的诊断准确性；miR-484，miR-642，miR-217和miR-181a可预测耐药的发生，miR-509-3p，miR-145，miR-181a，miR-34可抑制铂类耐药细胞株的增殖；miR-34c是唯一的可作为无复发的独立预测标志物，miR-519与高级别浆液性癌（HGSOC）的低生存率有关。总结和讨论miRNAs在EOC诊断及治疗上的应用。

肿瘤标记，生物学；抗药性，肿瘤；卵巢肿瘤；微RNAs

卵巢上皮性肿瘤（epithelialovarian tumor，EOC）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，是导致妇女癌症死亡的第五大病因［1］。这种低生存率主要源于晚期诊断和几乎难以避免的化疗耐药。大多数的EOC是高级别浆液性癌（HGSOC），起初标准治疗方案的有效率几乎可达85%，包括肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化疗。尽管开始很有效，但5年生存率不到30%，大部分患者的复发是由于对化疗药物产生了耐药性。EOC化疗耐药性的产生与以下3个因素有关：首先，缺乏早期诊断的标志物；其次，缺乏针对铂类化疗疗效判断的患者分层体系，肿瘤起源和成分的不同会导致肿瘤异质性，因此铂类药物的治疗会有不同的效果，对铂类药物不敏感的亚型反而会引起肿瘤干细胞的增加，导致肿瘤复发；最后，缺乏监测化疗疗效的标志物，以致未能早期发现耐药。在化疗早期，确认出化疗敏感患者再进行治疗，可提高患者的生存质量和防止肿瘤复发。因此，迫切需要找寻早期诊断的肿瘤标志物和新的治疗手段来克服以铂类为基础的化疗过程中耐药的发生。微小RNA（miRNAs）能调控与耐药相关的多种基因是化疗耐药的研究热点。

1 miRNAs

miRNAs是20～22个核苷酸的长链非编码RNA，主要通过与转录后的特定序列结合而调控基因的表达［2］。miRNAs在核内被转录为起始转录本，经过一系列受严格调控的剪切，最终在胞质中形成有功能的成熟miRNAs。miRNAs经过这种复杂的转录和加工，能够识别特定的序列，有各种表达谱，已经成为细胞增殖和分化的重要调节子。miRNAs的表达异常与许多肿瘤的发病机制有关，包括卵巢癌。根据对肿瘤表型的不同调控作用，miRNAs可分为肿瘤抑制型miRNAs和促进原癌发生的致癌miRNAs（onco-miRs）。目前发现miRNAs是肿瘤发生各个环节中的关键调节因子，包括转化、转移、肿瘤干细胞的功能和化疗耐药。因此，miRNAs的调节机制正成为癌症治疗研究的热点领域［3］。EOC治疗中的两大主要障碍就是早期诊断的缺失和对铂类化疗的耐药的监测。而miRNAs的异常表达与EOC的发生以及化疗耐药产生的机制有关。

2 miRNAs与EOC的诊断

在过去的几十年里，CA125是卵巢上皮性肿瘤中应用最广泛的预后标志物，用于判断生存率、疾病分期以及患者对化疗的反应，但已有研究发现并非如此［4］。HGSOC的癌症基因组图谱（TCGA）分析发现，CA125并不能判断生存率，且CA125与化疗耐药并没有相关性［5］。因此，迫切需要寻找一种新型的耐药监测标志物。

miRNAs是最有价值的肿瘤标志物之一，包括在EOC中，主要因为其有以下特点：在肿瘤组织中异常表达；具有组织特异性；在福尔马林固定的组织中不会降解；在体液中存在。miRNAs表达谱是研究miRNAs的强有力工具。miRNAs已成为新兴的EOC可靠的预后标志物［6］。在临床应用中，可用于检测miRNAs的技术包括实时聚合酶链反应（real-time PCR），microRNA芯片，RNA测序和流式细胞学检测等。

miRNAs在卵巢生理功能的调控中具有重要作用，因此miRNAs表达异常是EOC的重要特征之一。在正常卵巢组织中高表达的肿瘤抑制家族中的miR-125b和miR-29b在EOC中也有异常表达。阐明正常卵巢组织中miRNAs在早期转化过程中的功能将有助于miRNAs在EOC早期诊断中的应用。迄今，仅发现miR-182与EOC的体外转化有关［7］。Chong等［8］发现miR-551b，miR-19b，miR-196b和miR-3198在EOC中明显升高，miR-8084，miR-3201，miR-3613和miR-7515明显降低。

miRNAs可以经细胞分泌进入血液循环，与AGO2蛋白形成复合物或包含在外来体中，逃脱RNA酶的消化，稳定存在于血液中［9］。研究发现联合检测血浆中的miR-205和let-7f可以提高EOCⅠ期的诊断准确性，联合检测miRNAs与CA125比单一检测CA125更可靠精确，可作为CA125的互补指标。此外，血浆中新发现的环状miRNAs在早期诊断中也很有前景［9-10］。

3 miRNAs与EOC的治疗

在卵巢癌的耐药中，miRNAs异常表达是一个很明显的特征。在卵巢癌耐药细胞系中，发现了5种发生改变的miRNAs（let-7e，miR-30c，miR-125b，miR-130a和miR-335）。在发生耐药患者的EOC组织中，let-7i是最早发现明显下调的miRNA。而且，在染色体Xq27.3位点聚集的8条miRNAs在EOC患者中持续下调，与早期复发和低生存率有关。EOC的化疗耐药与23种miRNAs有关，其中miR-484，miR-642，miR-217和miR-181a可预测耐药的发生。

miRNAs可以靶向作用于与耐药有关的激酶突变体，阻断包膜流出泵对化疗药的排除，抑制抗凋亡蛋白的作用，以及清除耐药的肿瘤干细胞（TICs）［11］，从而大大提高化疗疗效。有关铂类药物耐药机制的重要学说是ABC转运体家族外排泵上调、DNA修复酶和抗凋亡蛋白上调，导致细胞凋亡减少，增加了肿瘤细胞对铂类药物的耐药性。在铂类药物治疗中加入上调miRNAs或下调miRNAs的反义寡核苷酸能增加铂类耐药细胞的死亡率。miR-509-3p可通过与X链锁凋亡抑制因子（X-linked inhibitorofapoptosis，XIAP）结合抑制铂类耐药细胞株的增殖［12］。miR-145通过下调TRIM2作用于促凋亡蛋白Bim［13］，miR-181a通过直接作用于Bim发挥抗凋亡效果，Bim下调会导致卵巢癌对铂类药物的耐药性增加。miR-34家族可以通过直接作用于不同的抗凋亡基因促进肿瘤细胞凋亡。铂类药物治疗可以清除大多数分化的肿瘤细胞，但不能消灭TICs。TICs的特点是能无限增殖成相同的细胞，并分化成高增殖能力、侵略能力的后代，造成了具有抗药性肿瘤的增殖。乙醛脱氢酶（ALDH）是最有公信力的卵巢癌TICs标志。CD133和ALDH结合进一步富集了EOC中TICs群。铂类药物无法清除EOC中TICs，但miRNAs可以，两者结合可以克服TICs的化疗耐药。已有研究报道敲低miR-214可以使分离自卵巢癌中的ALDH阳性细胞系对铂类药物和阿霉素的敏感性增加。

Park等［14］分析了ALDH阳性化疗耐药的SKOV3卵巢癌细胞的miRNAs表达，发现miR-23b，miR-27a，miR-27b，miR-346，miR-424和miR-503都存在过表达，和化疗敏感组相比，这些miRNAs也在化疗耐药的EOC肿瘤细胞中上调。因此miRNAs可以作为EOC中的TICs治疗策略。

此外，监测化疗疗效、早期发现耐药，确认出化疗敏感患者再进行治疗可提高患者的生存质量、防止肿瘤复发。研究发现，联合分析P-Smad2和miR-181a-5p可作为判断化疗疗效的标准［15］。

临床大量的EOC患者都有广泛转移和恶性腹水，这与低生存率相关联。因此，靶向转移性的卵巢癌细胞可以改善化学治疗效果，延长生命。转移始发于上皮间质转化（EMT），即位于上皮的肿瘤细胞获得了转移到其他器官的能力［16］。

miRNAs是肿瘤细胞中重要的EMT调控因子之一。抑癌miR-200家族是EOC中最常见的下调miRNAs，同时是EMT最开始的抑制剂，直接靶向EMT的正调节因子锌指E盒结合同源异形盒1（ZEB1）、ZEB2和波形蛋白（vimentin）［17］。miR-125a和miR-138后来被证明在卵巢癌中也可抑制EMT。近期发现miR-187，miR-34a，miR-506，miRNA-138，miR-30c，miR-30d，miR-30e-3p，miR-370和miR-106a等也与EMT有关［18］。

Sun等［19］通过对459例浆液性EOC的全面性分析，发现了一个抑制EMT的miRNA调控网络，与恶性度高的卵巢癌表型相关；并且发现miR-506可抑制EMT，靶向作用于SNAI2。miR-506的表达增加可以上调E钙黏蛋白（E-cadherin），抑制EMT，减少EOC癌细胞增殖、迁移和侵袭。miR-181a可直接作用于SMAD7、转化生长因子β（TGF-β）通路［20］，促进EOC中EMT的发生。抑制miR-181a可减少转移性卵巢癌细胞和迁移。靶向结合miR-181a的寡义核苷酸可以作用于治疗转移性癌细胞并改善EOC患者的存活率。

肿瘤微环境是肿瘤异质性产生场所，增加了诊断和治疗的困难。miRNAs在肿瘤微环境中起着重要作用，因此miRNAs调控可以作为靶向肿瘤微环境，克服耐药性的有力工具［21］。EOC中典型的肿瘤微环境比其他肿瘤更复杂，因为EOC的起源是多向的。肿瘤微环境中肿瘤相关的纤维母细胞（CAFs）可能是EOC的发病源，并且miRNAs可对其进行调控。在这方面最早Mitra等［22］的研究中，发现了3个miRNAs能将正常纤维母细胞变成CAFs。与正常纤维母细胞相比，CAFs里miR-214和miR-31下调，miR-155上调。因此，miRNAs调控模仿这个异常转变可以将正常细胞变成CAFs。这项研究凸显了miRNAs靶向微环境的重要性，EOC肿瘤间质的miRNAs调控是一个值得探索的领域。

此外，还可以通过酶抑制剂和miRNAs联合应用靶向治疗EOC。抑癌miRNAs与靶向原癌基因的siRNAs结合治疗也有很好的疗效。Nishimura等［23］使用抑癌miR-520d-3p和靶向原癌基因的EphA2结合。加入miR-520d-3p的优势是EphA2和EphB2的转录同时被抑制，这也突出了miRNAs可以靶向作用于多个基因的能力。

4 miRNAs与EOC的预后

肿瘤抑制因子miR-200家族是最先被发现的与EOC预后有关的miRNAs之一，miR-200a、miR-200b和miR-200c升高提示肿瘤进行性发展［24］。miR-21升高和miR-125b降低与HGSOC患者的预后差有关，miR-25可作为独立的预后因子［25］。miR-34c是唯一的可作为无复发的独立预测标志物，miR-519与HGSOC的低生存率有关。

目前EOC最全面的TCGA通过联合分析miRNAs的表达谱和4种主要的卵巢癌组织学类型，发现与低生存率有关的只有8种下调的miRNAs（miR-25，miR-506，miR-29c，miR-182，miR-128，miR-101，miR-141和miR-200a），预测可调控89%的发生改变的miRNAs相关基因。因此，构建EOC生存率相关的miRNAs网络尤为重要。

5 展望

对miRNAs在卵巢组织的功能研究面临的主要困难之一是，由于EOC的异质性，很难获取再现EOC发病机制的体内模型以及找出EOC各亚型的驱动基因。有研究通过配对盒基因8（Pax8）启动子，敲除输卵管上皮组织中的p53，乳腺癌易感基因2（Brca2）和10号染色体缺失张力蛋白同源磷酸酶基因（PTEN），构建了一种新型的HGSOC小鼠模型［26］。EOC的发病机制中最常见的是BRCA1和TP53两个肿瘤抑制基因的改变。而BRCA1和TP53恰好与miRNAs合成有关，因此，miRNAs表达异常与EOC的发生密切相关。在BRCA1/2发生异常的HGSOC中，miR-29a和miR-29b表达上调。在p53通路存在缺陷的EOC中，miR-31发生丢失，将其过表达后，发现有治疗的作用。有研究发现，miRNAs可作为转录激活剂调节肿瘤亚型［27］，虽然这些现象在EOC仍需验证，但为研究miRNAs在EOC的诊疗中的作用又提供了一个新的思路和方向。

miRNAs的给药方式是实现miRNAs药物临床应用的首要问题。多种改良版的给药方式都在体内试验中进行了尝试［28］。MRX34是目前进行临床试验的抗肝癌药物，通过脂质体包裹给药。有研究报道，在EOC裸鼠模型中，通过纳米脂质体包裹miR-506腹膜内给药将有效避免肝脏代谢，是一种很有效的给药方式。

miRNAs在肿瘤细胞中异常表达已被证实多年，但应用于临床肿瘤的治疗仍有许多困难需要克服，尤其对于EOC这种肿瘤异质性明显和恶性程度高的肿瘤。

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Progress in the Diagnosis and Treatment ofmiRNAs in Epithelial Ovarian Tumors

XU Fei，QIAN Li-li，WU Da-bao，

ZHOU Ying.Department of Obstetrics and Gynecology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China

ZHOUYing，E-mail：caddie1234@gmail.com

Epithelialovarian tumor（EOC）is themost lethalgynecologicmalignancy，and it is the fifth leading cause of cancer deaths in women.In order to improve survival in women with advanced EOC，it is important to overcome the drug resistance.miRNAs can actonmultiple genes associated with a chemoresistantphenotype，which have been the promising tools in this regard.miRNAs deregulation has been identified as an important feature in EOC.Combination ofmiR-205 and let-7f expression in plasma samples of EOC patients provided high diagnostic accuracy for stageⅠdisease in EOC；miR-484，miR-642，miR-217 andmiR-181a can predict resistance，miR-509-3p，miR-145，miR-181amiR-34 can inhibit proliferation of platinum resistantcell lines；miR-34c is the onlymarkersas predictorof relapse，miR-519 is related with low survival rate.The function ofmiRNAsas prognostic and therapeutic tools in EOCwassummarized here.

Tumormarkers，biological；Drug resistance，neoplasm；Ovarian neoplasms；MicroRNAs（JInt Obstet Gynecol，2016，43：502-505）

2016-04-11）

［本文编辑王琳］

国家自然科学基金（81001168，81272881），安徽省自然科学基金（1308085MH122），安徽省科技厅年度重点科研项目（1301043053）

230001合肥，安徽医科大学附属省立医院妇产科

周颖，E-mail：caddie1234@gmail.com

△审校者