蛋白质组学应用于早期妊娠流产的研究进展

姚婷，侯海燕，陈娟，陈亚琼

·综述·

蛋白质组学应用于早期妊娠流产的研究进展

姚婷，侯海燕，陈娟，陈亚琼△

妊娠过程类似于半同种异体移植，母胎界面的功能失调与早期妊娠流产，如早期自然流产、复发性流产等有关，但具体发病机制仍不十分清楚。蛋白质组学是通过高通量、快速鉴定与定量分析细胞、组织、体液中的所有蛋白质组成、功能及蛋白之间的相互作用的学科，将蛋白质组学应用于早期妊娠流产病理机制研究，发现早期妊娠流产与胎盘滋养细胞的侵袭力不足、母胎界面血管形成异常、氧化应激、母胎界面免疫功能失调、凝血功能异常、肥胖等有关，有利于相关疾病的早期诊断。将蛋白质组学应用于不明原因复发性流产（URSA）的治疗研究，发现淋巴细胞主动免疫疗法可通过调整并恢复患者的免疫状态，从而维持妊娠，改善妊娠结局。综述蛋白质组学及其在早期妊娠流产中的应用。

蛋白质组学；流产，自然；流产，人工；诊断

妊娠过程是一个复杂、精细而又相互协调的过程，胚胎作为一种半同种异体抗原组织，从受精卵成功着床到胎儿的顺利娩出，离不开母胎界面的免疫耐受作用，若母胎界面的功能失调，可能导致妊娠期相关疾病的发生，如早期自然流产、复发性流产、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病、羊膜腔感染、胎膜早破、早产等，严重影响母胎的生命安全。蛋白质组（proteome）是指一个细胞或组织中由基因组表达的全部蛋白质，最早由澳大利亚科学家Wilkins等[1]提出，而蛋白质组学（proteomics）是以某一类型细胞、组织、体液中的所有蛋白质为标本，大规模、高通量、系统研究全部蛋白的组成、功能及其蛋白之间相互作用的学科[2]，现已广泛应用于医学领域，如肝病[3]、心脏疾病[4]等。将蛋白质组学应用于早期妊娠流产，以滋养细胞、绒毛组织、蜕膜组织、胎盘组织、羊水、血清等为标本，可以从分子水平研究相关疾病的发生机制，寻找生物标志物，以便早期诊断，更好地管理整个妊娠过程，改善妊娠结局。

1 蛋白质组学的概况

蛋白质组学是分子研究终点，也是对生物体性状的最直接反映，其研究内容主要包括表达蛋白质组学、结构蛋白质组学、功能蛋白质组学。其研究步骤包括：收集标本，制备样品，提取样品中的全部蛋白，再选择适宜的技术，如：双向电泳技术、液相色谱技术、层析技术、超离技术、质谱技术、免疫共沉淀技术、酵母双杂交技术、蛋白质芯片技术、同位素标记相对和绝对定量技术、生物信息学分析等[5]，找出差异蛋白及其相关信号通路，进而为揭示生命本质，为疾病的早期诊断提供生物标志物。

2 蛋白质组学在早期妊娠流产中的应用

2.1 早期自然流产早期自然流产是指妊娠在12周以前自行终止，胎儿体质量＜1 000 g，发生率约为12%，引起早期自然流产的原因复杂，主要包括：夫妇双方或一方的染色体或胎儿的染色体异常；孕妇高龄；孕妇存在黄体功能不全、多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常等基础疾病；生殖道解剖异常；生殖道感染；母胎界面免疫耐受失调等[6]。

尽管导致早期自然流产的原因很多，但仍有一部分原因不明，将蛋白质组学应用于早期自然流产，找出与流产相关的关键蛋白，可深入研究早期自然流产的发生机制。2006年Liu等[7]用荧光染色双向凝胶电泳找出6例早期自然流产和6例正常妊娠要求行人工流产术患者胎盘绒毛组织的差异蛋白，并用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/ MS）分析鉴定出13种表达下调蛋白，5种表达上调蛋白，这些蛋白与细胞的氧化应激，细胞增殖、分化、凋亡，以及蛋白水解等有关，参与早期自然流产的发生。2014年Ni等[8]提取了5例早期自然流产患者和5例正常妊娠要求行人工流产术者的胎盘绒毛组织中全部蛋白，用高效液相色谱-质谱联用同位素标记法等技术，搜索人类国际蛋白质索引（International Protein Index，IPI）数据库，共鉴别出3 423种蛋白，其中51种差异表达蛋白，经过生物信息学技术分析这些差异蛋白中12种蛋白分子可能参与自发性流产的生物过程，包括上调表达的TBC1D13、LARP4B、AHSG、P4HA2和BCS1L蛋白分子，下调表达的GSTM2、CUL7、NES（nestin）、RASIP1、SLC30A2、PBXIP1和FAM21，其中NES、AHSG、BCSIL、GSTM2和CUL7参与滋养细胞的分裂与凋亡过程，NES、P4HA2、PBXIP1和GSTM2与滋养细胞浸润子宫内膜能力有关，NES、CUL7、RASIP1、P4HA2和AHSG则参与母胎界面的血管形成，推测这些差异表达的蛋白是早期自然流产的分子体现，参与了早期自然流产的过程。因此，早期自然流产的发生可能与胎盘滋养细胞的侵袭力不足，母胎界面血管形成异常，氧化应激等有关。

2.2 复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）RSA是指与同一配偶发生连续3次或3次以上自然流产，其再次妊娠流产率达50%～70%，引起RSA的原因有染色体异常、内分泌失调、生殖道解剖异常、生殖道感染、凝血功能异常、环境因素和自身免疫性疾病等，但仍有50%的RSA患者原因不明[9]。

随着蛋白质组学广泛应用于临床研究，有很多研究者将其应用于RSA，以期找到不明原因RSA（URSA）患者的相关差异蛋白，针对流产原因给予相应的处理方法，防止流产的再次发生。临床上，相对于羊水、卵泡液等，血液样本较易取得，患者也较认可，Kim等[10]收集3例有URSA史和3例有生育史、无流产史健康妇女的血液，采用双向差异凝胶电泳（2-DE）及MALDI-TOF/MS技术，找出22个差异蛋白，其中5个蛋白能被蛋白质印迹法（western blot）印证，而胰蛋白酶抑制剂重链H4（inter-a trypsin inhibitor-heavy chain 4，ITI-H4）表达最具有差异性。另有研究发现，RSA的发生与辅助性T细胞1（Th1）/Th2比例失衡有关[11]，即Th1细胞升高，Th2细胞降低，Th2细胞与白细胞介素6（IL-6）细胞因子表达呈正相关[12]，故RSA患者体内的IL-6表达显著下降，而ITI-H4又可调节IL-6的表达[13]，推测RSA患者中差异表达的ITI-H4可能与IL-6、Th2有关，可作为RSA的标志物，有助于RSA的早期诊断。

胚胎是由卵子与精子结合形成的受精卵分化发育而来，卵泡液是卵子生成发育成熟的内环境，与卵子的质量、受精能力及胚胎质量有关，为了研究卵泡液与RSA的相关性，Kim等[14]抽取3例RSA患者及3例正常对照者的卵泡液，采用2-DE及MALDITOF-MS技术，发现RSA患者补体C3c E链、γ纤维蛋白原、抗凝血酶、血管紧张素原及血红素结合蛋白表达下调，且γ纤维蛋白原、抗凝血酶2种蛋白被Western blot、逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）及实时PCR印证。研究发现，γ纤维蛋白原，抗凝血酶均与凝血功能有关，而凝血功能障碍则可能导致RSA的发生[15]。纤维蛋白原是一种血糖蛋白，有α纤维蛋白原、β纤维蛋白原、γ纤维蛋白原3种不同结构，血浆低纤维蛋白原血症与早期流产[16-17]、出血[17]及伤口愈合障碍[18]有关。在敲除编码γ纤维蛋白原基因的小鼠实验中发现，纤维蛋白原通过维持小鼠母胎界面的血液循环及胚胎植入保持母胎界面功能稳定，维持小鼠妊娠[19]。抗凝血酶是一种丝氨酸酶抑制剂，调控血液的凝固和纤维蛋白的溶解，获得性或遗传性的抗凝血酶缺乏都会增加孕妇血栓形成风险，导致自然流产、RSA等妊娠期并发症的发生[20]。而卵泡液中γ纤维蛋白原，抗凝血酶缺乏导致RSA相关机制仍需进一步研究。

另有研究发现肥胖与RSA有关[21-22]。Metwally等[23]收集16例RSA患者（12例肥胖，4例体瘦）和5例正常育龄妇女（2例肥胖，3例体瘦）的子宫内膜，采用双向差异凝胶电泳及主成分分析发现：RSA患者与正常对照者比较，肥胖RSA患者与体瘦RSA者比较，结合珠蛋白表达量有差异，肥胖RSA患者的结合珠蛋白表达量较体瘦RSA者上调。结合珠蛋白是在肝脏合成的一种糖蛋白，其主要作用是结合多余的血红蛋白以预防血管内溶血[24]。也有研究表明结合珠蛋白与胚胎植入及肥胖有关[25-26]，肥胖个体的脂肪细胞处于缺氧状态，会释放出一系列包括结合珠蛋白在内的炎性标记物，由于肥胖的RSA患者长期处于炎性状态，在胚胎种植期间子宫内膜产生过多的炎性物质攻击胚胎，从而导致体质量指数（BMI）偏高的育龄期妇女RSA的发生，且炎性标记物结合珠蛋白的浓度与体质量指数呈正相关。另外肥胖RSA患者与体瘦RSA者比较甲状腺素运载蛋白、β-球蛋白表达是上调的[23]，这可能与处于慢性炎性状态的肥胖RSA患者母胎界面血管功能障碍有关。因此，肥胖是RSA的危险因素，对于肥胖的育龄期妇女必须控制体质量，改善体内炎性状态，减少不良妊娠结局的发生。

由于RSA的复发率高，临床上针对不同的病因，出现了不同疗法，如：孕激素治疗、免疫抑制疗法、抗血小板聚集疗法、淋巴细胞主动免疫治疗、低分子肝素治疗、静脉滴注免疫球蛋白治疗等，其中淋巴细胞主动免疫治疗使得URSA患者妊娠成功率达到90%以上[27]，但其疗效机制仍不清楚。为了阐明淋巴细胞主动免疫治疗的疗效机制，从以下3方面考虑：①正常妊娠是一种成功的“半同种移植”，母体的免疫耐受机制维持了胎儿的存活。②URSA是妊娠免疫耐受机制发生了失衡所致[28]。③淋巴细胞主动免疫疗法可以使约90%URSA患者维持正常妊娠[27]。高克非等[29]选取50例RSA患者和同期48例正常初次妊娠的早孕妇女为研究对象，应用蛋白质芯片和表面增强激光解析电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF/MS）技术检测血清蛋白质谱，结果显示，正常早孕与URSA免疫治疗前比较有82个差异蛋白，URSA免疫治疗后与免疫治疗前比较有35个差异蛋白，两者的“交集”蛋白有16个，提示正常妊娠和URSA免疫治疗后存在相似的且与URSA免疫治疗前相反的免疫耐受状态，而对得到的相关蛋白进一步的纯化、鉴定、印证，可以揭示妊娠免疫耐受的网络核心机制以及免疫治疗的疗效机制。

3 结语

近年蛋白质组学研究发展迅速，广泛地应用于各个领域，由于蛋白质本身结构复杂，强酸性、碱性、低丰度、难溶性蛋白质的分离仍是蛋白质组学的研究难点，需要在技术上进一步突破。一次或多次的早期妊娠流产排除如染色体异常等相关已知病因外，许多患者病因不明，但多与母胎界面的功能状态有关，运用蛋白质组学技术寻找与母胎界面功能相关的差异蛋白可以更好地阐述早期妊娠流产的病理生理机制，有助于早期妊娠流产的早期预警和早期诊断，有助于提前采取有效的干预措施，防止早期妊娠流产的发生，提高孕产妇及围生儿的生存率。

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Progress of Proteomics Applied to the Early Pregnancy Abortion

YAO Ting,HOU Hai-yan,CHEN Juan,CHEN Ya-qiong. Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193,China（YAO Ting）；Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of the Chinese People's Armed Police Force Logistics College,Tianjin 300162,China（YAO Ting, HOU Hai-yan,CHEN Juan,CHEN Ya-qiong）

CHEN Ya-qiong,E-mail:chenyq82@hotmail.com

Pregnancy is similar to semi allograft transplantation，the imbalance of the maternal-fetal interface coordination is closely related to early pregnancy abortion，such as：early spontaneous abortion,recurrent spontaneous abortion,but the pathogenesises are unclear.Proteomics is a scientific discipline which can analysis the composition,function and the relationship among proteins in cells，tissues，body fluids in a high flux,quickly identify，quantitative analytic way.The research that proteomics apply to early spontaneous abortion discovers that the pathogenesis relates to the superficial invasion of the trophocyte,the disfunction of the maternal-fetal vascular formation，oxidative stress，the maternal-fetal immune disfunction，the coagulation disorders,obesity and so on，it is benefit for early diagnosing.The research that proteomics apply to unexplained recurrent spontaneous abortion discovers that lymphocyte immunotherapy can maintain pregnancy and improve the outcomes of the pregnancy through improving the immune status.Now a review on proteomics and its application in early pregnancy abortion will be presented.

Proteomics；Abortion，spontaneous；Abortion，induced；Diagnosis（J Int Obstet Gynecol，2016,43：699-702）

2016-06-16）

[本文编辑秦娟]

300193天津中医药大学研究生院（姚婷）；武警后勤学院附属医院妇产科（姚婷，侯海燕，陈娟，陈亚琼）

陈亚琼，E-mail：chenyq82@hotmail.com

△审校者