关节液来源间充质干细胞研究进展

贾兆锋 徐晓 刘启颂 陈洁琳 段莉 朱伟民 熊建义 王大平



关节液来源间充质干细胞研究进展

贾兆锋 徐晓 刘启颂 陈洁琳 段莉 朱伟民 熊建义 王大平

间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员,起源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞治疗组织损伤。多种类型的成人结缔组织与器官间质可分离提取出MSC。研究证实，关节液(SF)也可分离出MSC。相比于其他组织来源的MSC，SF来源MSC(SF-MSC)具有更强的成软骨细胞分化能力，在软骨组织工程方面的应用前景广阔。该文就SF-MSC研究进展作一综述。

间充质干细胞；关节液；软骨组织工程

关节软骨损伤常继发于关节创伤或骨关节炎(OA)[1]，是临床治疗的难点，其原因是关节软骨自身无血供且再生能力差[2]。因此，学者们试图寻找可促进关节软骨再生并保持其结构完整性的最佳方法。近年来，组织工程技术的发展为治疗关节软骨损伤带来新希望，而间充质干细胞(MSC)作为组织工程重要的种子细胞一直是研究热点，其拥有强大的增殖能力和多向分化潜能，尤其在成软骨细胞分化方面具有优势，为软骨损伤修复组织工程提供了新思路[3-4]。

MSC可从各种类型成人结缔组织与器官间质如脐带、脐血、骨髓、滑膜、骨骼肌和脂肪组织等中分离提取[5-7]。针对不同组织来源MSC的研究证实，关节液(SF)可分离并提取MSC(关节液来源MSC，SF-MSC)，有望为关节软骨损伤治疗提供新策略[8]。

1 SF与SF-MSC

SF由滑膜内膜层细胞分泌，具有粘性，为不含颗粒物质的淡黄色透明液体。正常SF是血浆渗透液、滑膜组织和周围组织分解代谢产物的综合，如蛋白多糖和胶原分解的产物[9]。SF营养关节软骨，含有生长因子、促炎因子和抗炎因子[10]，可减少软骨之间的摩擦，起到界面润滑剂的作用[11]。

Jones 等[12]首次证实膝关节OA患者SF中可提取出SF-MSC。进一步研究[13]发现，SF-MSC水平在OA早期就开始显著上升，与未发病时相比增加7倍。在OA病理条件下，SF可诱发MSC从滑膜组织或其他组织迁移到SF中，从而使SF中MSC水平急剧升高[14]。

2 SF-MSC分离及培养

与其他来源MSC相比，SF取材容易，关节镜或关节穿刺操作不会损伤其他正常组织，且所需样本量少[15]。Morito等[16]在关节镜手术前，将生理盐水15 mL注入OA患者膝关节腔，反复活动膝关节后用无菌注射器抽取SF冲洗液。Kim等[17]行踝关节镜手术前，于踝关节腔内注射5 mL生理盐水，反复活动踝关节后抽取踝关节SF。

采用密度梯度离心和贴壁培养法分离提取SF-MSC，取得SF标本4 h内用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，使用过滤器过滤，常温离心后弃上清，培养基重悬细胞，接种到相应培养皿，使用改良培养基置于温箱培养，12～24 h 换液，除去未贴壁细胞，单层平板培养下连续观察细胞形态及生长状态，选择合适细胞克隆继续扩增培养，此为原代SF-MSC。待细胞生长至亚融合状态时，根据所获细胞量的多少传代接种，常取P3代细胞为目的细胞。研究[18-19]发现，基础培养基(MEM)和高糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)可最大限度地维持MSC处于未分化状态及增殖期良好的生长特性，其培养SF-MSC效果最佳。

3 SF-MSC鉴定

3.1 细胞形态

原代SF-MSC呈星形或多角形，部分可有伪足，扩增培养后，随着细胞密度的增加，P1代细胞可呈短梭形、长梭形或圆形。传代后，细胞汇合长满培养皿，形态相对均匀，呈类似旋涡状或向日葵样[20]。

3.2 免疫表型特征

Friedenstein等[21]最早指出，成纤维细胞集落克隆形成实验可识别扩增形成后贴壁的梭形克隆细胞，故可作为MSC的鉴定标准。国际细胞治疗协会(ISCT)下属间充质及组织干细胞委员会(MTSCC)提出人MSC的统一鉴定标准[22]：首先，MSC在标准培养条件下必须贴壁生长；其次，MSC必须表达CD90、CD44、CD105、CD73，不表达CD34、CD133、CD45、CD79α或CD19、CD14、CD11b、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)；最后，MSC必须具有多向分化潜能。

4 SF-MSC三系分化

4.1 成骨细胞分化

取P3代SF-MSC，以2×105/cm2接种于6孔板中，待细胞亚融合后，加入成骨分化诱导基础培养基(内含10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL、地塞米松1 nmol/L、β-甘油磷酸钠20 mmol/L、维生素C 50 mg/L)开始诱导。观察细胞形态动态变化可见，诱导3 d后细胞逐渐由梭形向三角形或多角形、方形或鳞片形转变；8 d时细胞外基质分泌开始增多，可见细小黑色颗粒分布于细胞质中及细胞质外，细胞质颜色变深，而细胞核颜色变淡；3周时培养皿内细胞大量聚集，形成类似钙结节状结构，局部可出现叠片状；4周时培养皿局部因大量细胞外基质沉积而呈棕黑色，成骨特异性碱性磷酸酶(ALP)染色可见细胞质中出现棕黄色或棕黑色颗粒沉淀，茜素红染色可见红色沉淀物，实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测显示Runx2、骨钙蛋白表达明显增高，完全符合成骨细胞特征[23]。

SF-MSC虽可诱导分化为骨细胞，但成骨能力不及骨髓间充质干细胞(BMSC)。Isobe等[7]通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测骨髓、SF、牙髓等来源MSC成骨分化诱导后骨钙蛋白mRNA表达量，发现BMSC成骨分化诱导后骨钙蛋白mRNA表达量最高，成骨分化能力最强。

4.2 成脂肪细胞分化

取P3代SF-MSC，以2×105/cm2接种于6孔板中，待细胞亚融合后，加入成脂分化诱导基础培养液(内含10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL、谷氨酰0.5 μmol/L、胰岛素0.5 μmol/L、异丁基甲基黄嘌呤0.5 μmol/L、吲哚美辛0.5 μmol/L、地塞米松0.5 μmol/L)诱导培养；观察细胞分化过程形态变化可见，诱导3～5 d时细胞逐渐由长梭形向短梭形转变；2周时细胞开始变为圆形或椭圆形；3周时细胞质内呈环状排列的脂滴形成，油红O染色呈强阳性，qPCR检测显示成脂特异性基因LPL、FABP4、PPARγ2表达增强，证实SF-MSC向脂肪细胞分化[17]。Ogata等[24]比较成脂分化后细胞表面标记物表达量，发现相比骨髓、滑膜、SF等来源的MSC，脂肪来源MSC可优先向脂肪细胞分化且拥有最强的成脂分化能力,但成骨、成软骨分化能力较弱。

4.3 成软骨细胞分化

取P3代SF-MSC，以2×105个接种于6孔板中，置于 37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中，待细胞达80%～90%融合后，加入软骨分化诱导培养基(内含转化生长因子-β3 10 ng/mL、纤维生长因子-2 2 ng/mL、维甲酸1 nmol/L、维生素C磷酸酯50 μg/mL、脯氨酸40 μg/mL、丙酮酸100 μg/mL、地塞米松100 nmol/L、胰岛素-转铁蛋白-硒预混合液50 mg/mL)中培养[25]。诱导1周时检测出Ⅱ型胶原阳性表达，并随时间的延长逐渐增强；2周时细胞逐渐由短梭形变为多边形，形态接近透明软骨细胞，随着诱导分化进程的持续，多边形细胞体积增大；3周后细胞完全类似透明软骨形态，甲苯胺蓝染色显示有软骨细胞特异性细胞外基质糖胺聚糖(GAG)成分，Ⅱ型胶原mRNA表达显著增高，Ⅰ型胶原mRNA不表达，表明可形成稳定的透明软骨细胞[26]。

研究[27]表明，SF-MSC不同于BMSC，它可形成富含软骨分化潜力大的克隆细胞集落。Yoshimura等[28]比较不同组织(骨膜、骨髓、滑膜、脂肪及肌肉等)来源MSC的增殖及成软骨分化潜能，发现滑膜来源MSC可产生较多的软骨基质并有较强的成软骨细胞分化能力。 Fulber等[29]进一步研究发现，SF-MSC产生软骨细胞外基质较滑膜来源MSC多，它有更好的成软骨分化性能，更易形成透明软骨细胞。

5 SF-MSC应用

5.1 安全性

Fulber等[29]通过动物模型实验证实，SF-MSC无致瘤性，并指出马滑膜来源MSC和SF-MSC是安全的。SF在MSC表型特征表达和细胞分化过程中均无致瘤性，且利于软骨细胞分化。此外，使用自体SF-MSC移植治疗可避免免疫排斥反应和伦理学方面的争议。

5.2 种子细胞

种子细胞、细胞因子、支架材料是软骨组织工程的基本要素[30]，选择合适细胞因子作用于MSC并复合支架材料来修复软骨损伤是目前研究的热点，如何优化诱导条件、得到优质的组织工程化透明软骨是目前研究的方向[20]。

Chiang等[31]将猪SF-MSC与含富血小板血浆(PRP)的温敏水凝胶复合，体外培养3周，分别在1、7、14、21 d检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达水平，发现其表达量随培养时间的延长而增加，将上述复合物置入猪股骨髁软骨缺损处，分别于4、8周取材，经大体观察及组织学染色证实，含SF-MSC的水凝胶修复效果佳，4周时缺损处大部分被透明软骨样组织覆盖，8周时缺损区已完全修复；推测在体内生理环境下，复合材料中的SF-MSC可被诱导形成功能性透明软骨细胞。

SF-MSC定向成软骨细胞分化应用于软骨损伤修复再生方面的优势明显，可提高软骨生物力学性能。此外，SF-MSC定向成软骨细胞分化过程可表达多种透明软骨细胞样特异性标记，并可诱导形成稳定的透明软骨样组织[32]。

尽管有大量的SF-MSC体外基础实验研究，但目前SF-MSC的体内应用研究很少且尚无人SF-MSC临床应用的报道，可能与SF-MSC在机体中发挥的具体作用机制不明有关。

6 存在问题

6.1 确切组织来源

SF-MSC的确切组织来源尚无定论。Jones 等[12]研究认为，SF-MSC可能来源于分解脱落的软骨、骨、滑膜、骨膜、骨髓等组织。Morito等[16]研究认为，膝关节SF-MSC可能来源于滑膜组织，原因为相比于BMSC，SF-MSC形态、基因表达谱及细胞集落大小均与滑膜来源MSC类似。Sun等[33]研究认为，颞下颌关节脱落的内膜组织是颞下颌关节SF-MSC最可能的来源。

6.2 特异性标志物

Kolf等[34]研究认为，共同表达STRO-1、CD73和CD106是鉴别MSC最有效的表面标记物组合。Krawetz等[35]研究证实，健康人群或OA患者SF-MSC阳性表达CD105、CD73和CD44，阴性表达CD45RO、CD11和CD34；CD90+细胞比CD90-细胞有更强的成软骨细胞分化潜能，CD90受体与整合素、酪氨酸激酶、生长因子等有关，可促进下游细胞活动，如细胞黏附、凋亡、增殖、迁移等。Nagase等[18]研究认为，体外培养SF-MSC 7 d，40%～60%的细胞表达CD90，但随后表达逐渐降低，成软骨细胞分化潜能也随之下降，表明CD90可能影响SF-MSC成软骨细胞分化。

BMSC可表达神经节苷脂GD2，单一的神经节苷脂GD2表面标志物有助于从骨髓周围组织中区分出BMSC[36]。来自内脏或皮下的脂肪源性MSC因来源部位不同，也可有不同特点。研究[37]表明，表达CD10细胞表面标记物的MSC为皮下脂肪来源MSC，而表达CD200细胞表面标记物的MSC则为内脏脂肪来源MSC。然而，目前SF-MSC的特异性标志物尚无定论，其鉴定还需综合多种指标[15]。

6.3 建立体外培养及诱导分化的稳定体系

体外培养及扩增过程中，SF-MSC也会出现衰老和凋亡。细胞肥大化在体外诱导分化培养过程中依然严重。Zheng等[38]研究报道，SF-MSC在体外培养时，其增殖能力和多向分化潜能随培养时间的推移而逐渐降低。

Henrionnet等[39]、Madry等[40]研究认为，在不考虑细胞原始来源的情况下，维持成软骨细胞表型特征或促进MSC向软骨细胞分化的重要因素为生长或可溶性因子、机械负荷、环境因素(如缺氧刺激)。MSC向软骨细胞分化过程中，联合骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β等可有效维持软骨细胞表型与提高转化效率[41]。静水压是体内关节环境的重要组成部分，它与MSC成软骨分化能力密切相关[42]。低氧条件下(3%O2)分离和扩增MSC可增强其形成稳定软骨细胞的能力且可能是控制细胞肥大化的潜在工具[43]。值得注意的是，目前大多数研究都限于1种或结合2种上述因素，尚缺乏将3种因素结合的相关实验研究。如何维持SF-MSC高效的分化状态及稳定的细胞表型是亟待解决的问题。

7 结语

SF-MSC较易从SF中分离和培养，来源广泛，并能迅速大量扩增，自我更新能力强，拥有多种分化潜能，特别是成软骨细胞分化能力突出，可作为软骨再生组织工程理想的种子细胞来源。但目前对于SF-MSC的研究尚处于起步阶段，很多问题尚未解决，限制了其应用和发展。尽管如此，随着对SF-MSC研究的不断深入，相信其将在构建组织工程化软骨及临床应用中发挥重要作用。

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(收稿：2016-07-27；修回：2016-09-05)

(本文编辑：李圆圆)

国家自然科学基金面上项目(81572198)、广东省自然科学基金(2015A030313772)、深圳市科技创新委员会基础研究布局项目(JCYJ20160301111338144)、深圳市科技创新委员会技术攻关项目(JSGG20140519105550503)

510182， 广州医科大学深圳市第二人民医院临床学院(贾兆锋)；518035， 深圳市运动医学技术工程研究中心(贾兆锋、徐晓、刘启颂、陈洁琳、段莉、朱伟民、熊建义、王大平)；518035， 深圳市组织工程重点实验室(贾兆锋、徐晓、刘启颂、陈洁琳、段莉、朱伟民、熊建义、王大平)

王大平 E-mail: dapingwang1963@qq.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.008