肿瘤相关巨噬细胞与骨肉瘤

刘政选 王晓旭 符勇 方松清



肿瘤相关巨噬细胞与骨肉瘤

刘政选 王晓旭 符勇 方松清

骨肉瘤是发病率最高的骨恶性肿瘤，在儿童及青少年中最为常见。研究发现，肿瘤微环境在骨肉瘤的发生发展中发挥重要功能，其中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)广泛参与骨肉瘤生长、血管新生、转移及干细胞样表型表达等。该文对TAM与骨肉瘤的研究现状作一综述。

骨肉瘤；肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤微环境

骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，好发于股骨、胫骨和肱骨等长骨干骺端，以局部侵犯和早期肺部转移为主要特点，患者预后极差[1]。近几十年来，关于骨肉瘤患者总生存情况的研究一直处于瓶颈状态[2]。随着研究不断深入，在发现针对骨肉瘤实质细胞的治疗不能对患者预后有明显改善后，越来越多的研究转向肿瘤微环境方面[3]。既往研究[4]显示，在常见的恶性肿瘤中，肿瘤微环境与肿瘤恶性表型密切相关，且可促进恶性肿瘤血管新生、局部浸润及转移，是恶性肿瘤进展的危险因素。巨噬细胞作为肿瘤微环境中含量最多的炎性细胞，与人类多种恶性肿瘤密切相关，为影响恶性肿瘤患者预后的独立因素[5]。

1 肿瘤相关巨噬细胞来源及分型

肿瘤微环境是指由间质细胞、细胞外间质、细胞因子及趋化因子等构成的局部病理环境，它是一个动态变化的整体，可与肿瘤细胞相互作用：一方面，微环境影响肿瘤细胞，为肿瘤生长、血管生成及转移提供条件；另一方面，肿瘤自身也影响着所处微环境的理化状态。肿瘤微环境在骨肉瘤发生发展中起着重要作用，其细胞组成主要包括间充质干细胞(MSC)、破骨细胞、成纤维细胞和炎性细胞，其中巨噬细胞是骨肉瘤微环境中含量最多的炎性细胞。

巨噬细胞来源于单核细胞，可迁移到不同组织中，分化为功能各异的细胞，在组织中起维持平衡、促进炎症反应及调节免疫的作用。与正常组织中的巨噬细胞相同，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)也来源于外周血循环的单核-巨噬细胞，在趋化因子CCL2、CCL5、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)-β等作用下，单核细胞向肿瘤组织中浸润，继而在局部微环境影响下被诱导极化成M1型和M2 型TAM。

2 TAM对肿瘤发生发展的影响

M1型TAM(即经典激活的巨噬细胞)由脂多糖(LPS)和干扰素(IFN)-γ等刺激极化而来，高表达白细胞介素(IL)-1、IL-12、 IL-23、活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)，低表达IL-4 和IL-10，有较强的抗原提呈能力，主要功能为杀灭被吞噬的细菌、病毒及肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的发生发展[6]。炎症介质IL-10 或IL-4 可促进TAM向M2型极化，M2型TAM高表达IL-10、清道夫受体CD163及甘露糖受体CD206等，低表达IL-12和IL-23，抗原提呈能力较弱，在组织修复、免疫抑制和促进肿瘤生长中扮演重要角色[6]。局部微环境发生变化时，M1型TAM与M2型TAM可相互转化；激活或阻断TAM的Notch信号转导通路可使TAM向M1型或M2型极化[7]。阻断TAM的核因子-κB(NF-κB)信号转导通路可使TAM向M1型极化，表现为高表达IL-12，低表达IL-10，从而抑制肿瘤的发生发展[8]。目前研究认为，众多恶性肿瘤如肝细胞癌[9]、胰腺癌[10]、胃癌[11]等细胞间质中高度浸润的TAM主要表现为M2型，可促进肿瘤发生发展，为影响患者预后的危险因素。目前TAM在骨肉瘤中的表型尚未明确，其对骨肉瘤的生长、血管新生、转移及干细胞样表型的影响各有不同，甚至存在分歧。

2.1 对骨肉瘤生长的影响

多种信号转导通路、分子与骨肉瘤的生长有关。Yang等[12]研究发现，通过转染使骨肉瘤中的组蛋白修饰因子MacroH2A高表达能下调细胞周期素D及细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)表达，从而抑制骨肉瘤细胞增殖。Ma等[13]通过体外实验发现，夹竹桃苷能抑制骨肉瘤中Wnt/β-catenin信号转导通路，同时降低基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的活性，导致骨肉瘤细胞凋亡。Li等[14]研究发现，微小RNA(miRNA)-143能抑制B细胞淋巴瘤基因(Blc)-2表达，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3，导致骨肉瘤细胞凋亡。

多数恶性肿瘤中TAM呈M2型，可通过分泌内皮生长因子(EGF)等生长因子直接或间接促进肿瘤细胞生长[15]。Hu等[16]研究发现，M2型TAM可上调细胞周期蛋白D1表达，促进子宫内膜癌细胞增殖。Yang等[17]研究发现，M2型TAM能促进Bcl-2表达，抑制乳腺癌细胞凋亡。Xiao等[18]研究证实，骨肉瘤组织中大量M2型TAM浸润,与骨肉瘤的增殖密切相关。体内实验[19]发现，注射氯膦酸盐可减少骨肉瘤小鼠模型中的巨噬细胞数量，使小鼠肿瘤体积显著减小；免疫组化检测显示，骨肉瘤的移植瘤多为F4/80(一种巨噬细胞标志物)阳性，且移植瘤的TAM表现为M2型。骨肉瘤细胞高表达EGF,但骨肉瘤的生长仅受内皮生长因子受体(EFGR)及TAM调控，与EGF无关。Pahl等[15]研究证实，脂质胞壁三肽与IFN-γ共同诱导极化的M1型TAM能抑制骨肉瘤细胞生长；当骨肉瘤细胞株与西妥昔单抗共同培养时，IL-10诱导极化的M2型TAM也能抑制骨肉瘤细胞的生长。因此，M2型TAM在某些因素作用下，也可能抑制骨肉瘤的生长。但TAM对骨肉瘤生长的影响机制尚待进一步研究。

2.2 对骨肉瘤血管新生的影响

肿瘤血管新生是指在原有血管的基础上，各种因素通过内皮细胞增殖、细胞外基质(ECM)降解及内皮细胞迁移、重构，以出芽的方式形成新的血管，进入肿瘤组织内，为肿瘤发生发展提供必要条件，是肿瘤十大特征之一。促进肿瘤血管新生的因子包括VEGF 、EGF、成纤维细胞生长因子(FGF)及TGF-β等，其中以VEGF的促血管生成作用最为重要，它能与内皮细胞的特异性受体flt和flt/KDR结合，促进内皮细胞增殖，刺激新生血管形成[20]。同时，MMP能破坏ECM，诱导内皮细胞迁移，也能促进血管新生[21]。骨肉瘤的发生发展过程也需要血管。骨肉瘤中的VEGF能激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号转导通路，使骨肉瘤微血管密度(MVD)增加，促进血管生成[22]。大量研究发现，精子相关抗原-9[23]、骨膜蛋白[24]及IL-6[25]均能通过提高骨肉瘤中VEGF的表达促进其血管新生。骨肉瘤组织中高表达的低氧诱导因子(HIF)-1α与MVD的增加呈正相关，是患者预后不良的重要因素[26]。

TAM能分泌各种促血管生成因子(如VEGF、FGF、MMP-9等)参与血管新生的每个过程。大量研究[27]证实，TAM易聚集在肿瘤组织的低氧部位，而肿瘤组织的低氧环境能促使TAM中HIF-1α活性增高，从而分泌大量VEGF及MMP等促血管生成因子，促进血管新生。研究发现，在多种恶性肿瘤如胶质母细胞瘤[28]、乳腺癌[29]及胃癌[30]等中，TAM能通过促进肿瘤组织中VEGF的表达以促进肿瘤血管新生，是导致患者预后不良的重要因素。Werno等[31]研究发现，在敲除HIF-1α基因的乳腺癌中，TAM向M2型极化，肿瘤组织血管再生能力减弱。上述研究结果与一般认为M2型TAM促进肿瘤血管新生的观点相悖，有待进一步论证。Segaliny等[32]研究发现，IL-34能使巨噬细胞在骨肉瘤组织中聚集，促进骨肉瘤血管新生。因此，VEFG是骨肉瘤血管新生最重要的影响因素，骨肉瘤组织中浸润的TAM可能通过促进VEFG表达来诱导骨肉瘤新生血管生成，但具体机制尚需进一步探索。

2.3 抑制骨肉瘤转移

肿瘤转移是指肿瘤从原发灶通过淋巴管、血管或直接蔓延等多种途径到达其他部位继续生长的过程。上皮间质化(EMT)是指在多种因素影响下，上皮细胞黏附能力减弱，而运动能力增强，失去细胞极性，转变为具有转移能力的间充质表型的上皮细胞的过程，是肿瘤发生转移的起始阶段。Notch信号转导通路能激活骨肉瘤EMT，促进骨肉瘤转移[33]；Wnt信号转导通路的配体及受体在骨肉瘤细胞株中高表达，能提高骨肉瘤转移的能力[34]。骨肉瘤组织中的VEGF[35]、埃兹蛋白[36]及趋化因子受体CXCR3[37]等水平也与骨肉瘤的转移呈正相关。Cheng等[38]研究发现，重楼皂苷Ⅶ能激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号转导通路，下调MMP-2及MMP-9水平，减少ECM降解，抑制骨肉瘤转移。

在肿瘤转移过程中，TAM既能上调MMP水平使ECM降解[39]，又能通过激活多种信号转导通路激活EMT[40]。Liu等[41]研究发现，M2型TAM可通过激活Toll样受体(TLR)4/IL-10信号转导通路促进波形蛋白、上皮细胞钙黏蛋白等间充质细胞标志物表达，提高MMP-9、MMP-2的活性，激活EMT，介导胰腺癌转移。Lee等[42]研究发现，M2型TAM可激活Gas6/Axl-NF-κB17信号转导通路，促进EMT，介导口腔癌转移。Lin等[43]研究发现，M2型TAM能分泌趋化因子CCL18，下调miRNA-98 和miRNA-27b基因表达，激活EMT，介导乳腺癌转移。

综上所述，多数恶性肿瘤中高度浸润的TAM主要表现为M2型，可促进肿瘤转移。Buddingh等[44]研究发现，在高度恶性的骨肉瘤中，TAM同时具备M1型及M2型TAM的特点，且TAM数量越多，骨肉瘤患者发生转移的概率越低，生存期越长，提示在高度恶性骨肉瘤中，TAM可能主要表现为M1型TAM的特点，即抑制骨肉瘤转移，但TAM如何抑制骨肉瘤转移尚需进一步研究。

2.4 上调骨肉瘤肿瘤干细胞样表型

肿瘤干细胞(CSC)是恶性肿瘤中一小群具有自我更新能力、高度耐药性及多种分化潜能且增殖迅速的细胞，与肿瘤的发生、复发、转移及耐药密切相关[45]。Lapidot等[46]首次通过实验发现人类急性髓性白血病中存在CSC，之后学者们陆续从多种实体肿瘤如胰腺癌、肝癌、肺癌及胃癌等中分离出CSC。Gibbs等[47]于2005年首次从骨肉瘤中分离出CSC，其特征为高表达MSC特有的表面标志物如CD133、CD177 和Sro-1。随着研究的深入，学者们[48]发现Oct3/4和Nanog蛋白等也可作为骨肉瘤CSC样表型的标志物。TGF-β1信号转导通路[49]、Notch信号转导通路[50]能上调骨肉瘤CSC样表型，而Wnt信号转导通路[51]能抑制骨肉瘤CSC样表型上调。

研究[52]表明，TAM能促进CSC样表型上调。TAM能通过激活TGF-β1信号转导通路导致EMT，促进肝细胞癌CSC样表型上调，但EMT介导CSC样表型上调具体机制尚需进一步研究[53]。此外，TAM也可通过调控EGFR/Stat3/Sox-2信号转导通路上调Scal-1和ABCG2等CSC样表型[54]。在大多数恶性肿瘤中，TAM通过不同信号转导通路上调CSC样表型。因此，骨肉瘤中的TAM也有可能通过TGF-β1信号转导通路促进EMT，上调CSC样表型。而TAM上调骨肉瘤CSC样表型的机制以及骨肉瘤中CSC对TAM极化的影响，有待进一步研究与探索。

3 结语

TAM在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。促进M2型TAM向M1型转化，从而抑制肿瘤的发生发展是目前研究的热点。研究[55]表明，丙酮酸激酶(PK)M2能促进TAM向M2型极化。Liu等[56]研究发现，PKM2在骨肉瘤中高表达，其为导致骨肉瘤患者预后不良的重要因素，这或许能为骨肉瘤TAM的研究提供新的方向。TAM在骨肉瘤中的作用研究尚处于初始阶段，存在诸多问题。大多数研究将CD163作为M2型TAM的表型标志物，但CD163在树突状细胞等中也有表达[57]。TAM在骨肉瘤中主要表现为何种表型可能与骨肉瘤分期及分化程度有关。骨肉瘤微环境如何影响TAM表型变化及TAM与骨肉瘤相互作用机制，尚需进一步探索。

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(收稿：2016-09-15；修回：2016-10-08)

(本文编辑：李圆圆)

湖南省教育厅资助项目(15C1215)

421000 湖南衡阳， 南华大学附属第二医院骨科(刘政选、王晓旭、符勇)； 421000 湖南衡阳， 南华大学临床技能中心(方松清)

方松清 E-mail: fangsongqing123@163.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.011