原虫硫氧还蛋白研究进展

熊　康,周金林

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫病重点实验室，上海 200241)



原虫硫氧还蛋白研究进展

熊康1,2,周金林2*

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫病重点实验室，上海 200241)

摘要:硫氧还蛋白(Trx )是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白质，它和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸Ⅱ(NADPH)共同构成了硫氧还蛋白系统，是硫氧还蛋白系统的重要组成部分。顶复门原虫作为胞内寄生虫，自身缺乏抗氧化的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，依靠硫氧还蛋白系统抵抗宿主的氧化作用。论文介绍了原虫Trx的结构，从抗氧化应激和蛋白结合等方面阐述了Trx的生物学活性及功能，介绍了Trx及其抑制剂在抗肿瘤等方面的研究进展，为抗原虫药物的发现提供参考。

关键词:原虫；硫氧还蛋白；结构；功能；抑制剂

顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫，包括巴贝斯虫(Babesiaspp.)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)、疟原虫(Plasmodiumspp.)及艾美耳球虫(Eimeriaspp.)等，是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构和保守的入侵机制。当这些寄生虫寄生在红细胞内时，如恶性疟原虫，就会暴露在高浓度的活性氧中，而疟原虫自身缺乏抗氧化的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶。因此，疟原虫的生存取决于它的宿主细胞和其自身过氧化物酶的抗氧化能力。其中，疟原虫的硫氧还蛋白( thioredoxin,Trx )系统发挥着重要作用，被认为是疟原虫抵御过氧化物的主要防线。本文针对近几年国内外关于原虫Trx的研究现状进行综述。

1原虫硫氧还蛋白结构

Trx是一种分子质量大约为12 ku的小分子蛋白质，分布十分广泛，从古生菌、细菌到哺乳动物都有分布。1964年，Moore E C等[1]首次将大肠埃希菌中发现的这种蛋白质定义为Trx。随后，1967年，他们在大鼠的肝癌细胞中发现了此种蛋白[2]，1977年，Pigiets V P等[3]在大肠埃希菌中通过柱子层析纯化得到硫氧还蛋白，并发现它参与到大肠埃希菌的一系列氧化还原反应中。1991年，在猪的心脏组织中首次发现Trx2，1995年，Gasdaska P Y等[4]从哺乳动物细胞中成功克隆出细胞质中的Trx1和线粒体中的Trx2。从此，关于Trx的一系列研究相继展开，近些年研究发现，Trx除了参加基本的氧化还原调节外，还参与机体其他许多重要的生命活动，如生长因子作用、蛋白结合作用、抗凋亡作用等。因为其与人类疾病的关系而受到人们的重视，人们在皮肤损伤、阿尔茨海默病、肿瘤、人类免疫缺陷病毒感染等疾病中都发现有Trx的存在。目前，国内外关于巴贝斯虫Trx的报道很少，此前有过关于疟原虫Trx的报道，因巴贝斯虫和疟原虫都属于顶复门原虫，因此可以将Trx作为治疗巴贝斯虫病的一个潜在药物靶点。

Trx二级结构是由4个β折叠和3个α螺旋组成的球状蛋白，折叠顺序为β1、α1、β2、α2、β3、β4、α3[5]。各种生物的Trx都有相类似的活性中心和立体的三维结构，4个β折叠构成一个疏水核心，其外围被3个α螺旋包绕着，活性中心位于β2折叠的尾部和α2螺旋的起始端之间，这种折叠结构普遍存在于氧化还原蛋白家族中。Trx的保守序列主要为-Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-(WCGPC)，它是Trx参与氧化还原反应的重要活性位点，调节氧化还原活性的二硫键位于该保守序列中，活性部位由高度保守的残基Trp81和Asp111之间的氢键稳定[5]，这些高度保守的氨基酸对维持Trx的三维结构也有很大的作用[6]。氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫键，还原型Trx[Trx-(SH)2]含有巯基，Trx的还原机制在于其与底物X-S2结合后，在复合物的疏水环境中，Cys32的巯基作为亲核物质与蛋白底物结合形成共价键的二硫化物，最后去质子的Cys35作用于此二硫化物的二硫键，释放出被还原的蛋白底物，其自身从还原型变成氧化型，可以通过TrxR和NADPH的作用恢复到氧化型。

在恶性疟原虫中，包括3种能被TrxR还原的Trx1-3和2种硫氧还家族样蛋白(Tlp1-2)[7]。在疟原虫的Trx中，Trx1是研究得最多的，它具有WCGPC活性位点，位于细胞质中，包含105个氨基酸。Trx2活性位点为-Trp-Cys-Gln-Ala-Cys-(WCQAC)，它可以被TrxR还原，并且可以提供电子给硫氧还原蛋白过氧化物酶类(peroxiredoxins)[7]。Trx2仅位于线粒体中，由166个氨基酸构成[8]。Trx2除了保守的原序列外，还包含了60个氨基酸残基组成的N末端延伸，称为引导序列。这段引导序列对于Trx2存在于线粒体内部起关键作用，如果缺乏该序列，Trx2前体就不能成熟，并不能进入线粒体而留在细胞质[9]。由于Trx3重组蛋白的溶解性问题，其特征有待阐明。Trx3在体外可被TrxR还原，其在胰岛素测定时很活跃，可用于胰岛素法测Trx活性试验[7]。Trx3位于内质网，在那里它可能通过形成二硫化物参与蛋白质的折叠。Tlp1-2显示出与Trx序列高度的同源性，但不能被TrxR还原。Tlp1位于胞质中，活性位点为WCGPC，也可以用于胰岛素法测Trx活性试验[7]。Tlp2位于线粒体，但其在线粒体氧化还原系统中的功能仍有待阐明，它以序列-Try-Cys-Ala-Pro-Cys-(WCAPC)作为其活性位点，但其详细活性还未被研究。

2Trx的生物活性与功能

2.1抗氧化应激作用

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是已知的胞内信号传导级联介体，ROS的过量产生会导致氧化应激，使细胞功能的丧失，并最终凋亡或坏死。细胞内氧化和抗氧化系统之间的平衡对细胞调节和适应不同的生长条件至关重要，Trx与TrxR相结合是一种普遍存在的氧化还原酶系统，具有抗氧化和氧化还原调控作用。Trx在细胞里主要通过硫氧还蛋白过氧化物酶来发挥它的抗氧化特性，硫氧还蛋白过氧化物酶属于抗氧化剂蛋白的保守家族，这个家族称为非硒依赖的过氧化物酶蛋白家族(peroxiredoxins，Prdxs)。

还原型的硫氧还蛋白过氧化物酶清除的氧化剂主要有H2O2和烷基过氧化物，在这个过程中，硫氧还蛋白过氧化物酶和其他家族成员通过保守半胱氨酸(Cys)之间的二硫键形成二聚体。Trx能将氧化型硫氧还蛋白过氧化物酶还原成单体形式[10]。硫氧还蛋白过氧化物酶在人类红血细胞里被发现，其作为抗氧化剂保护红血细胞免受氧化剂的损伤。Trx去除细胞内H2O2的另一种机制是通过硒和谷胱甘肽过氧化物酶，使用还原型谷胱甘肽来清除过氧化物。硒对硫氧还蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶系统有不同的影响，它能增加硫氧还蛋白还原酶的活性，但不影响硫氧还蛋白过氧化物酶，以及可以提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，但不影响谷胱甘肽还原酶。因此，在过氧化物过量存在的情况下，增加硒的量可能会增加Trx/还原型谷胱甘肽的量。

在恶性疟原虫体内，Trx1可以直接与氧化型谷胱甘肽结合，并有效地还原它，因此，Trx1可以作为对谷胱甘肽系统的补充[11]。Trx1通过直接解毒H2O2、叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide，tBuOOH)、异丙苯过氧化氢(cumene hydroperoxide，CHP)和S -亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione)，发挥它的抗氧化应激作用，还可以通过与抗坏血酸盐(ascorbate)、硫辛酸( lipoic acid)和硫辛酰胺(lipoamid)共同作用，维持它的抗氧化应激能力。此外，Trx1还可还原硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶和疟原虫特异性硫醇蛋白[12]。Trx1与蛋白质相互作用，参与蛋白质折叠，转录和翻译，糖酵解，血红蛋白分解代谢和信号转导，并且经由硫醇交换机制可特异性还原S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase)、S-腺苷基-L-高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase)和鸟氨酸转氨酶(ornithine-aminotransferase，OAT)。Trx1通过还原一个底物解合环的二硫键来激活OAT的酶活性，从而提高OAT与它底物的亲和力，这可能对调节鸟氨酸稳态和多胺合成对于细胞内氧化还原状态的起到相应控制作用。在谷胱甘肽一部分与半胱氨酸残基共价结合的基础上，Trx1参与并调节S-谷胱甘肽蛋白质翻译后的修饰，导致该蛋白质的结构或活性的改变，在还原条件下，谷胱甘肽一部分可以被氧化还原酶Trx1还原，从而恢复相应的蛋白质活性[13]。通过用NMR光谱对Trx1的结构进行研究，发现Trx1二硫键的形成导致Trx1总体结构的变化，这可能是Trx与蛋白质相互作用必须发生的改变。

2.2蛋白结合作用

当恶性疟原虫感染红细胞时，其生存取决于疟原虫数百种蛋白质(自身蛋白质组的5%～7%比例)输出并包围成液泡的能力。蛋白质的输出是由寄生虫衍生的蛋白质复合物——疟原虫输出蛋白易位子(Plasmodiumtranslocon of exported proteins，PTEX)介导的，并且经PTEX通过液泡膜之前，不同的蛋白质需要被展开，这种展开由蛋白质HSP101/ ClpB2解叠酶和Trx2执行。当疟原虫HSP101/ ClpB2有缺陷或缺乏Trx2时，蛋白质的输出大大受损。输出的蛋白质中25%是疟原虫生存和介导其毒力所必不可少的[14]。

该PTEX由5个亚基组成，分别为EXP2、HSP101 / ClpB2、PTEX150、Trx2和PTEX88。其中EXP2、PTEX150和HSP101/ ClpB2 3个亚基组成PTEX的核心复合物，是蛋白质的输出通道，可以从疟原虫形成的液泡膜上提取[15]。膜上相关的亚基EXP2(exported protein-2)可能是一个候选的跨膜蛋白传导孔，并且在结构上类似于溶血素，细菌成孔溶细胞α-螺旋毒素[16]。用于输出的蛋白质受液泡分泌信号或疟原虫输出元素(Plasmodiumexport element，PEXEL)调控，该PEXEL的蛋白水解加工由内质网蛋白酶天冬氨酸蛋白酶V完成，以便蛋白质能够输出[17]。蛋白质在输出之前需要被展开，展开由HSP101/ ClpB2和Trx2共同完成，其中Trx2与输出蛋白质结合，还原蛋白质的二硫键以促进输出。

当疟原虫缺乏PTEX150或HSP101/ ClpB2时，输出蛋白会大量减少，减少的种类超出了形成液泡膜需要的种类。PTEX150或HSP101/ ClpB2适度的敲除对疟原虫完成其生命周期中的红细胞阶段的能力有很大的影响。当突变的疟原虫缺乏TRX2或PTEX88时，其生命周期中的血液阶段发展缓慢，生命活动严重受损[18]。所以，EXP2，PTEX150或HSP101/ ClpB2在疟原虫血液感染阶段发挥中心作用，PTEX88和Trx2在PTEX介导蛋白质输出有重要调控作用，也维持疟原虫正常的血液生长阶段[19]。

所以，Trx2在疟原虫蛋白质输出过程中发挥重要作用，它是PTEX的重要亚基组成部分，输出的蛋白质要与Trx2结合，还原其二硫键，展开要输出的蛋白质，协助蛋白质输出。疟原虫Trx2的晶体结构显示出不同的静电表面，使得疟原虫Trx2和人类硫氧还蛋白有着不同的作用机制。疟原虫Trx2靶向药物可能会干扰蛋白质分泌到宿主红细胞，为抗疟疾药物的发现提供新的研究方向[20]。

另外，在哺乳动物中，Trx2也发挥着蛋白结合作用。Trx可以与许多种细胞蛋白结合，这种蛋白结合仅发生在还原型Trx，而氧化型或突变型C32S/C35S的Trx不能与蛋白结合[21]。Trx与蛋白结合的机理尚未阐明，但可能涉及Trx一个催化位点的Cys和其他蛋白质中的Cys之间形成了稳定的二硫键。某种蛋白质与Trx结合后，蛋白质接收到的是凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)、ASK1是c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase ，JNK)和p36 MAP激酶的活化剂，也参与TNF-α诱导的细胞凋亡[22]。还原型Trx能与ASK1的N端部分结合，以抑制其活性，ASK1的N端残基去掉后不会影响ASK1的基本活性，而且ASK1也不会受Trx的调节。TNF-α会引起Trx的氧化导致Trx与ASK1的解离，从而ASK1会被激活，这可能有助于TNF-α诱导的细胞凋亡。但是，Trx与其他蛋白质结合是否具有生理意义仍有待确定。已经发现Trx相关蛋白p32TrxL能与哺乳动物STE-20样(MST)激酶的催化片段结合。在CD95(FAS，载脂蛋白-1)诱导细胞凋亡的过程中，MST被蛋白酶蛋白水解激活，已经被证明能产生蛋白酶激活的下游凋亡信号[23]。

2.3Trx的其他作用

在哺乳动物细胞中，Trx除了有蛋白结合作用外，生长因子作用和抗凋亡也是其重要功能。

Trx作为一种生长因子，可以由B细胞、T细胞以及肝癌细胞产生，也可以由淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞，以及各种癌细胞分泌，分泌发生的机理尚不清楚。Trx能刺激淋巴细胞、正常成纤维细胞和各种肿瘤细胞系的生长，它不是由Trx催化位点Cys32→Ser/Cys35→Ser的突变来刺激细胞的生长，Trx这种刺激细胞生长的机理表明它是一种非典型的生长因子。并不是所有的生长因子受到Trx的影响作用都会增强，例如乳腺癌细胞的MCF-7、胰岛素、表皮生长因子的作用就不会增强，而白细胞介素2(IL-2)的作用会被增强1 000倍，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的作用会被增强100倍。Trx也能增加各种细胞因子在细胞中的表达，包括IL-1、IL-2、L-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，以及人类风湿性关节炎成纤维细胞中，诱导TNF-α表达IL-6和IL-8[24]。

Trx加入到培养基中，能防止由于L-半胱氨酸和谷胱甘肽耗竭诱导的淋巴样细胞的细胞凋亡，还能防止B型慢性淋巴细胞白血病细胞因TNF-α分泌增加引起起的凋亡，起到保护B型慢性淋巴细胞白血病细胞的作用，这是这些细胞与自分泌生长相关的因素[25]。我们已经发现，人Trx转染到小鼠WEHI7.2淋巴样细胞后，能抑制许多药物诱导的细胞凋亡，这些药物包括地塞米松、星形孢菌素、毒胡萝卜素和依托泊苷。转染Trx抑制的细胞凋亡与转染抗凋亡癌基因Bcl-2抑制细胞凋亡的方案是类似的。当接种到重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠中，转染Trx的细胞形成的肿瘤会更加迅速地增长，并显示出比机体细胞或转染Bcl-2的细胞更少的自发凋亡。在有地塞米松抑制的情况下，肿瘤也可以耐受而生长。因此推测在体内，Trx为肿瘤提供了一个生存及生长优势，不像Bcl-2只提供生存优势，并且需要其他基因的变化来刺激肿瘤的生长[26]。Trx抗凋亡作用的机制现在还不清楚，如上所述Trx结合到ASK1介导的TNF-α诱导的细胞凋亡作用已经提出。

3Trx抑制剂

Trx刺激生长的效应在许多人的原发肿瘤中表达，这就提高了Trx有助于侵袭性肿瘤的生长和患者预后差的可能性。此外，因许多抗癌药物引起的Trx抑制细胞凋亡是抵抗抗癌药物细胞毒性作用的原因，有可能增加Trx可以引起化疗耐药。这些发现使Trx成为抑制癌细胞生长的药物靶标，几种这样的化合物也已确定，包括1-甲基羟丙基2-咪唑基二硫化物(1-methylhydroxypropyl 2-imidazolyl disulfide，PX12)，它被确定是通过与Cys73残基结合的一种Trx抑制剂，被PX-12生长抑制的各种细胞株的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)是8.1 μmol/L。在SCID小鼠体内，PX-12已被证明具有对抗人类肿瘤异种移植物的体内抗肿瘤活性。在人体肿瘤被PX-12抑制生长与Trx mRNA的表达密切相关。Trx的其他几种抑制剂已经确定，由美国国家癌症研究所对60岁人肿瘤细胞系组进行测试，从超过50 000种化合物中得到的，这几种抑制剂具有类似的PX-12细胞杀伤活性。一种化合物叫2,5-双[(二甲基氨基)甲基]环戊酮( 2,5-bis[(dimethylamino)methyl]cyclopentanone，NSC131233)，它是Trx的不可逆抑制剂，它的IC50为1.0 μmol/L。

Trx还原其他蛋白是通过半胱氨酸的巯基/二硫键的互变。残基C82的巯基可能是第1个亲核点去攻击底物蛋白的二硫化物，Trx和其底物之间以分子间二硫键连接，然后由残基C85的巯基发动第2轮亲核攻击，最后释放还原底物。含金元素的药物表现为巯基和硒的活性物质，容易与巯基结合。特别是金-有机金属化合物，如AURO-硫代苹果酸和AURO-硫葡萄糖在体内和体外都表现出很有效的抗疟疾作用。这两种药物对治疗类风湿性关节炎是行之有效的，也是潜在的抗锥虫和抗利什曼原虫药[26]。它们是公认的硫氧还蛋白还原酶抑制剂，该酶可以使Trx从氧化态变成还原态。AURO-丁二钠也能抑制疟原虫Trx，强亲硫的金原子可能与Trx中C82、C85的2个巯基进行类似的作用。

目前，已有关于Trx或TrxR靶向治疗的报导。莫特沙芬钆(motexafin gadolinium， MGd)可以通过间接抑制Trx的活性而延缓肿瘤的生长。在Trx-1转染的人乳腺癌细胞系MCF-7中，Trx-1可能通过上调抑癌基因p53的表达，从而有效地抑制顺铂诱导的人乳腺癌细胞程序性死亡。在有关肝细胞癌的研究中，Trx被证实可抑制顺铂诱导的程序性细胞凋亡，表明在肝细胞癌的治疗中Trx可作为重要的药物治疗靶标。有人在人乳腺癌细胞系MCF-7中利用三氧化二砷来抑制TrxR的活性时发现，癌细胞的生长活性降低，即三氧化二砷可通过硫氧还蛋白系统途径来治疗癌症。

4小结

有关哺乳动物Trx的报道较为广泛深入，研究表明其具有多种生物活性，包括抗氧化剂、蛋白结合、生长刺激、抑制细胞凋亡等。Trx的二聚体形式可导致其氧化还原活性丧失。Trx在原虫中的研究相对较少，尤其是巴贝斯虫。此前有过关于疟原虫Trx的报道，由于疟原虫类原核生物缺乏抗氧化的过氧化物酶，因此，疟原虫依赖它的宿主细胞和其自身过氧化物酶的抗氧化能力，这些都涉及硫氧还蛋白系统，此系统被认为是疟原虫对抗过氧化物主要防线的代表，硫氧还蛋白是过氧化物酶中的一个重要代表。巴贝斯虫和疟原虫都属于顶复门原虫，有关疟原虫的研究为巴贝斯虫Trx功能探索提供了一定的借鉴和参考，使Trx成为具备了成为新的药物靶点的可能，为治疗巴贝斯虫病提供了新的方法。

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Progress on Thioredoxin of Protozoa

XIONG Kang1,2, ZHOU Jin-lin2

(1.CollegeofLifeandEnvironmentScience,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai，200234,China; 2.ShanghaiVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryoftheMinistryofAgricultureAnimalParasitology，Shanghai，200241，China)

Abstract:Thioredoxin (Trx), involved in the thioredoxin system with thioredoxin reductase (TrxR) and NADPH,is a small molecule protein and widely presents in prokaryotes and eukaryotes.Apicomplexan protozoa, as intracellular parasites, are lack of antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase.They rely on the thioredoxin system to resist host oxidation.This paper described the structure of protozoa Trx and the biological activity and function of Trx from oxidative stress and protein binding, and also introduced the research progress about Trx inhibitors on anti-tumor,and provided new research directions for the discovery of anti-protozoal drugs.

Key words:protozoa; thioredoxin; structure; function; inhibitor

文章编号:1007-5038(2016)04-0077-05

中图分类号:S852.72;Q51

文献标识码:A

作者简介：熊康(1988―)，男，湖南益阳人，硕士研究生，主要从事田鼠巴贝斯虫研究。 *通讯作者

基金项目：国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(2015CB150300)

收稿日期：2015-08-11