ANCA相关性血管炎的实验室诊断及研究进展

闵　彦，王　燕，胡成进



ANCA相关性血管炎的实验室诊断及研究进展

闵彦，王燕，胡成进

［关键词］ANCA相关性血管炎;蛋白酶3;髓过氧化物酶;实验室诊断

［作者单位］250031济南，济南军区总医院实验诊断科

1　血管炎的分类

血管炎是一组异质性疾病，均以血管壁炎症为主要表现。目前已经认识的系统性血管炎至少有20种。血管炎首先按受累血管的大小进行分类，包括小血管(毛细血管和毛细血管后微静脉)、中等血管(肌性动脉和小动脉)和大血管(主动脉及其主要分支)。韦格纳肉芽肿(肉芽肿性多血管炎)(GPA)、显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)及Churg-Strauss综合征(嗜酸细胞肉芽肿性多血管炎) (EGPA)是一组累及小至中等血管并具有一些相同临床、病理和实验室特征的血管炎。抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)是诊断以上3种小血管炎的有效工具［1］。

2　ANCA相关性血管炎的实验室检测

ANCA的靶抗原有10余种，与临床最相关的是蛋白酶3 (PR3)和髓过氧化物酶(MPO)，两者与ANCA相关血管炎及这些疾病的肾脏表现密切相关［2］。2012年CHCC命名会议认为，临床上对血管炎患者分类，需要包括抗原的特异性以及血管炎的临床病理表型，比如说，是PR3-MPA，还是MPO-MPA［3］。间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IIF)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)联合应用是检测ANCA相关血管炎的最佳方法。对临床疑诊为ANCA相关性血管炎的患者建议进行ANCA测定，并针对抗PR3抗MPO特异性抗体进行检测［2］。

用IIF检测乙醇固定的中性粒细胞共有3种荧光模型。(1)c-ANCA，是弥散的胞浆荧光颗粒，在90%活动性的GPA中阳性。其靶抗原主要是PR3。其他靶抗原包括杀菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)等。(2)p-ANCA，是一种中性粒细胞核周的染色，主要见于MPA和EGPA。其靶抗原主要是MPO。其他靶抗原包括乳铁蛋白(lactoferrin，LF)、溶酶体(lysozyme，LYS)、组织蛋白酶G(cathepsin G，Cath G)、BPI等。(3)非典型ANCA，即AANCA。A-ANCA比较少见，主要是同时胞浆染色和核周染色，或者是细胞核染色，具有多种抗原的特异性。A-ANCA主要和药物暴露、关节炎或者类风湿病相关，很少见于血管炎。其靶抗原目前尚不清楚，LF、LYS、BPI都有报道，但无统一结论［4-5］。

用乙醇固定的中性粒细胞检测ANCA易受到抗核抗体的干扰，用甲醛固定的中性粒细胞检测ANCA可以排除这种干扰。Lin等［6］研究表明，中性粒细胞的双基质片(用乙醇和甲醛分别固定中性粒细胞)可以更好的辨别标本是否是ANCA阳性。中性粒细胞的双基质固定是用IIF检测ANCA的重要策略之一。

抗MPO抗体阳性强烈提示坏死性血管炎或特发性新月体型肾小球肾炎(NCGN)。64%的坏死性NCGN患者可检测出抗MPO抗体，MPA患者阳性率为60%，EGPA患者阳性率为50%，GPA患者阳性率为24%。除EGPA病例外，上述病例的大部分MPO阴性患者都可检出抗PR3抗体阳性。MPO-ANCA在10%～15%的SLE中存在，可能与慢性炎症有关，如动脉炎、浆膜炎和C-反应蛋白增高。抗PR3抗体在临床上与GPA密切相关。敏感性取决于疾病的活动性和病期阶段，在初发不活动的GPA中，阳性率只有50%，而在活动性典型性GPA中，几乎100%阳性。PR3-ANCA在其他原发性血管炎中也可被检测到，如MPA、NCGN等［7］。

除了系统性血管炎外，ANCA在炎症性肠病和自身免疫性肝病的诊断和鉴别诊断过程中也具有重要意义［7］。pANCA与炎性肠病(IBD)相关。IBD包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩(Crohn disease，CD)2种疾病。pANCA在UC患者血清中阳性率为60%～80%，而在CD患者中阳性率为10%～20%［5］。此外，ANCA在原发性硬化性胆管炎(PSC)的阳性率为60%～80%，在原发性胆汁性肝硬化(PBC)的阳性率为30%，ANCA还与自身免疫性肝炎(AIH)相关。

3　ANCA相关性血管炎检测技术研究进展

3．1间接免疫荧光法的成像分析系统虽然有很多可替代的筛查方法出现，对于用ANCA筛查血管炎，IIF仍然是推荐的方法。但是，这种方法的可信性取决于很多因素，包括底物、酶及阅片人的经验等。为了解决这些问题，以计算机为基础的间接免疫荧光法的成像分析系统已经开始应用于ANCA的检测。ANCA的IIF成像分析系统有很多优势:如节约标本和试剂，缩短检测时间等。有些检测系统已经商业化，它们可以检测有无ANCA的存在，并且可能区分特别的荧光模式。

AKLIDES(Medipan GmbH，Germany)是一种IIF成像分析系统。这种系统可以分析荧光的强度，并且在结合乙醇染色和甲醛染色的基础上，分析基本的ANCA模型。Knutter等［8］研究表明，这种自动荧光分析系统与人工分析相比，在区分是否是ANCA方面高度一致，在结合乙醇和甲醛染色的基础上，可以较好的判断荧光模型。但是，在判读胞浆和非典型ANCA时，这种自动判读系统的敏感性，不及人工［8］。Damoiseaux小组［9］研究也表明，自动判读系统识别PR3-ANCA阳性(乙醇固定)的AAV时，敏感性较人工低。但它对甲醛染色C-ANCA识别较好。对于MPO-ANCA阳性的血清，自动判读系统对乙醇固定中性粒细胞的P-ANCA识别较好，但对甲醛固定中性粒细胞的C-ANCA模型识别较差。与人工相比，在ANA存在的情况下，这种自动分析系统区分AANCA及P-ANCA比较困难［9］。因为ANCA的荧光模型预示着ANCA抗原的特异性，因此，自动识别系统需要在识别乙醇固定中性粒细胞荧光模型方面优化［4］。

CytoBead技术是一种结合细胞和磁珠的数字化IIF分析技术，可同时进行ANCA初筛和确认实验。Sowa等人研究表明，CytoBead技术所确认的PR3-ANCA，MPO-ANCA，P-ANCA，C-ANCA，与经典的ANCA分析法具有一致性，两者没有明显的差异。CytoBead技术具有多重分析功能，可同时进行初筛以及确认实验，是一种使用自动数字化IIF的快速有效的ANCA分析技术［10］。间接免疫荧光法的自动识别系统对于ANCA的筛查是一个具有前景的技术。但是，在临床应用之前，还需要进一步的改进和多中心对它的评估。

3．2特异性抗原的免疫测试传统的直接ELISA是将抗原直接包被在固体板上，而捕获式ELISA及锚定式ELISA都将抗原固定在单克隆抗体或“桥分子”上。抗原特异性的捕获式ELISA可用来检测PR3-ANCA和MPO-ANCA。锚定式ELISA主要是检测PR3-ANCA。捕获式ELISA或锚定式ELISA法与IIF相结合，可最大程度提高AAV患者血清的检测敏感性。因为抗原特异性的捕获式ELISA和锚定式ELISA检测PR3-ANCA与MPO-ANCA具有更好的可操作性，所以，很多学者对目前ANCA相关血管炎的实验室诊断流程发出质疑，建议先以ELISA作为第一步的初筛实验，再以IIF进行确证实验［4］。在稍早些的研究中，Russell［11］就提出了类似的建议。Russell等在常规实验室的检测条件下，比较了标准化IIF、MPO直接ELISA以及PR3捕获式ELISA的检测效率。结果表明，PR3-ANCA以及MPO-ANCA联合检测具有最好的敏感性，用IIF检测的C-ANCA具有最好的特异性。Russell提出，为了保持最大的诊断准确性，并节约人工劳动，可以先用ELISA进行初筛，再用IIF进行确认。这种新的流程有待于多中心的联合验证，以确认是否是一种具有更好敏感性和特异性的检测方法［12］。

3．3其他的免疫学检测方法包括免疫印迹法、侧向层析法、基于流式细胞术的磁珠法及电化学发光法测定。De Joode等人研究表明，印迹法与ELISA一样，可迅速检测ANCA和抗肾小球基底膜抗体，有利于提高血管炎患者的检出率，是有力的快速诊断工具［13］。Damoiseaux等［14］研究发现Europlus ANCA Biochip(印迹法膜条)对ANCA相关血管炎的诊断敏感性和特异性，与IIF及ELISA法的联合应用具有一致性。免疫印迹法属于定性测定，结果最终还需用ELISA法的定量测定。Offermann小组［15］证实了侧向层析法检测PR3及MPO的抗体，与ELISA法的检测结果，有很好的一致性。侧向层析法的优点在于经济，特别有利于早期和准确诊断。而基于流式细胞术的磁珠法测定特异性不及联合应用IIF和ELISA法，敏感性与IIF类似，比ELISA法敏感性更强一些，特异性与ELISA法类似［16］。此外，电化学发光法也用于检测PR3和MPO两种抗体。Mahler等［17-18］进行的一项大型多中心的研究表明，电化学检测法具有更好的动力学范围，更完整的线性稀释曲线及更好的批间和批内精密度。与现有的ELISA试剂盒相比，电化学发光法检测PR3和MPO抗体的敏感性和特异性具有一致性。

4　ANCA对临床诊断的意义

ANCA检测只是临床诊断的辅助手段，必须结合患者的病史、影像学及临床症状来诊断，血管炎的组织学检测是金标准，每个待检患者都需要做这方面的检测［4］。ANCA在监测疾病活动性、指导对AAV患者的处理方面的作用，仍然是有争议的。北京协和医院诊疗常规认为，PR3-ANCA抗体滴度与病情活动一致，在GPA等原发性血管炎患者，常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。但Tomasson等［19］所做的meta分析表明，ANCA在监测疾病复发方面的作用很有限。在随访的AAV患者中，ANCA滴度的上升，并不伴随着病情的复发。医生可能更倾向于通过尿常规来监测病情的复发。通过捕获式或锚定式ELISA检测来监测AAV的复发，还需更好地研究才能应用于临床［5，19］。

总之ANCA相关性血管炎的实验室诊断具有重要的作用，但必须结合患者的病史加以分析，才能更好的服务于临床诊断和治疗。新发展的ANCA诊断技术，包括以计算机成像技术为基础的IIF识别系统，锚定式或捕获式的ELISA，都具有较好的发展前景。以计算机成像技术为基础的IIF识别系统有可能在将来取代人工阅片。但最终的ANCA检测报告，还需要有资质的实验室人员进行确认。锚定式或捕获式的ELISA有可能取代IIF成为一种ANCA的初筛方法。快速检测PR3和MPO抗体的检测方法包括印迹法、电化学发光法等，有利于快速诊断复发的血管炎患者并对其进行处理，以防止疾病的恶化和肾衰的出现。

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(本文编辑:林永丽)

(收稿日期:2015－06－06)

［中图分类号］R34

［文献标识码］A［DOI］10．3969/j．issn．1009－0754．2016．01．037