白芨环阿屯烷型三萜对血管生成和肿瘤细胞增殖的抑制作用

刘明志

（惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007）

白芨环阿屯烷型三萜对血管生成和肿瘤细胞增殖的抑制作用

刘明志

（惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007）

研究白芨环阿屯烷型三萜对血管生成和肿瘤细胞增殖的抑制作用.通过大鼠动脉环血管生成模型观察白芨三萜对血管生成的抑制作用，通过MTT法检测白芨三萜对HeLa细胞增殖的抑制率，通过流式细胞术分析白芨三萜对细胞凋亡和细胞周期的影响.50 μg/mL和100 μg/mL的白芨三萜对大鼠动脉环微血管生成具有显著抑制作用.白芨三萜处理HeLa细胞后，其IC50为61.33±1.78 μmol/mL.白芨三萜阻止细胞于G1期，且具有诱导凋亡和坏死的双重作用.白芨三萜可抑制血管生成和肿瘤细胞增殖.

白芨；环阿屯烷三萜；血管生成；肿瘤细胞

白芨［Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.］是兰科白芨属中的一种常用中草药，为多年生草本，其入药部分为干燥的地下根状茎.由白芨制备的白芨胶常用于血和栓塞剂用于肿瘤介入疗法中发挥作用，在肿瘤内形成致密填塞，并能阻止肿瘤的再血管化［1-2］.有报道白芨多糖可诱导人脉静脉血管内皮细胞增殖，促血管内皮生长因子表达［3-4］，因而，不能很好解释白芨作为血管栓塞剂是如何阻止肿瘤的血管生成.笔者通过多年研究，首先白芨中的一种萜类化合物可诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡［5-6］，在此基础上进一步纯化这种化合物并进行分子结构鉴定，确定为一种环阿屯烷型三萜［7］.本研究证明该环阿屯烷型三萜可抑制大鼠动脉环微血形成和抑制肿瘤细胞增殖，表明可作为一种抗肿瘤的先导化合物.

1 材料与方法

1.1 材料

HeLa细胞株购于广州暨南大学.雌性白色大鼠购于中山大学实验动物中心.白芨环阿烷三萜［7］由本实验室自制，分子式为C32H54O，相对分子质量为454.37.

1.2 主要试剂及仪器

基质胶（matrigelTMMatrix）购于BD Biosciences公司；重组人血管内皮生长因子（VEGF Human）为ProSpec-Tany TechnoGenen Ltd（Isreal）产品；改良型RPMI-1640培养基和DMEM高糖培养基购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；胰蛋白酶（1:250）购于Genview公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Ho.33258购于北京雅安达生物技术有限公司；碘化丙啶（PI）购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）购于广州斯佳生物科技有限公司.紫杉醇（paclitaxel）标准样品购自中国食品药品检定研究院，纯度为99.6%.通用酶标仪ELX 800；CO2培养箱HERAcell 150i；液氮样品储存罐Biorack 750；倒置荧光显微镜AE31 EF-INV；二级生物安全柜BHC-1300IIA/ B 2；流式细胞仪EPICS XL.

1.3 实验方法

1.3.1 白芨三萜对大鼠动脉环微血管形成的抑制作用

脊椎脱臼处死法处死大白鼠，置75%酒精15 s，然后迅速置于无菌操作台上解剖大鼠，取出胸主动脉，用PBS缓冲液清洗数遍，洗去血液去脂肪等组织，切成1 mm左右长度的动脉环，置于用改良型RPMI-1640培养基稀释1倍的基质胶（4℃预冷过夜液化，在4℃预冷条件下操作）的48孔培养板中包埋1 h.待固化1 h后，进行以下处理：对照组加入100 μL培养基，实验组一加入99.8 μL培养基及0.2 μL VEGF，实验组二至组六中加入不同体积的培养基及0.2 μL VEGF以及不同体积的环阿屯烷型三萜母液（6 μg/μL，用无水乙醇配制），使得最终浓度分别为5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/ mL，50 μg/mL，100 μg/mL.2 d后置倒置显微镜下观察新生微血管数目标，连续观察至第6 d，采用双盲法计数新生微血管数目，每组随机选取5个视野计数微血管并照相.将微血管进行分级：0至99条分为0级，100至199条分为1级，200至299条分为2级，300至399条分为3级，400至499条分为4级，500条以上分为5级.

1.3.2 白芨三萜对HeLa细胞的抑制作用

培养至对数期的HeLa细胞，经消化后调整密度为2×104/mL，悬浮于含10%小牛血清的DMEM（高糖）培养基中，接种于96孔培养板中，每孔体积100 μL.培养24 h后待细胞贴壁后进行实验处理.实验设空白组、对照组和实验组，每组设5个复孔.实验组各孔中加入不同浓度的白芨三萜溶液.空白组不加细胞悬液，改加同体积的培养基.然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h.然后加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，同样条件下继续培养4 h.4 h后弃除上层液，每孔加入DMSO 100 μL，常温震摇5 min以促进蓝紫色结晶甲瓒溶解.用酶标仪于490 nm测其吸光值.细胞抑制率用下面公式计算：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%.

1.3.3 流式细胞仪检测白芨环阿屯烷三萜对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响

周期检测：取对数生长期细胞，吸出培养液，PBS洗一次，加入0.25%胰酶和0.02%EDTA-Na2适度消化，加入含血清培养基终止消化后转入离心管，800 r/ min离心15 min，去上清.预冷PBS洗2次，800 r/min离心15 min，收集细胞沉淀.加入5 mL预冷的70%乙醇，4℃固定过夜.取出复温，800 r/min离心15 min，去乙醇，预冷PBS洗2次，800 r/min离心15 min，加0.5 mL Binding Buffer悬浮细胞，吹打均匀，浓度大约为1.0× 106个/ml.PI单染后上流式仪检测，以没做处理细胞组制备阴性和对照组.凋亡检测:取对数生长期细胞，收集培养液，PBS洗一次，加入0.25%胰酶适度消化，加入含血清培养基终止消化后转入离心管，800 r/min离心15 min，去上清，预冷PBS洗2次.合并所有吸出液体，800 r/min离心15 min，收集细胞沉淀.以没做处理细胞组制备双阴性、AnnexinV-FITC单染、PI单染、AnnexinV-FITC＋PI双染细胞来设门和做荧光补偿.在悬浮细胞液中加入5 μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀后于2～ 8℃避光孵育15 min.加入10 μL PI后轻轻混匀后于2～8℃避光孵育10 min，300目（孔径40～50μm）尼龙网过滤，上机流式细胞仪检测.

1.3.4 荧光染色法检测白芨环阿屯烷三萜对肿瘤细胞形态的影响

取对数生长期的HeLa细胞，吸去培养基，加0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，离心收集，弃上层液，加入新鲜培养基重悬，按2 mL/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h.然后向每孔加入100 μL不同浓度的白芨环阿屯烷三萜溶液，使其终浓度为20、50、100、150、200 μmol/L，设置一个对照孔：对照孔改加100 μL无水乙醇，相同条件下培养24 h.取出6孔培养板，向每孔加入20 μL配制好的Ho.33258染液（终浓度为10 μg/mL）和20 μL PI染液（终浓度为50 μg/mL），混匀，37℃培养箱中标记30 min.在倒置荧光显微镜下进行形态观察并照相记录.同时，以20 μmol/mL紫杉醇作处理上述HeLA细胞并进行染色和观察.

2 结果

2.1 白芨环阿屯烷三萜对VEGF诱导的大鼠动脉环微血管的抑制作用

大鼠动脉环经不同浓度白芨环可屯烷三萜处理后，结果如图1所示.

图1 白芨环阿屯烷三萜对大鼠动脉环血管生成的影响

1.对照组新生微血管情况；2.实验组一新生微血管情况；3，4，5，6，和7分别表示实验组二、三、四、五和六中的白芨环阿屯烷三萜的浓度分别为5，10，20，50和100 μg/mL时大鼠动脉环上的微血管生成情况；8和9分别表示新生微血管分级情况和条形图和折线图对照组中因为含有VEGF，但不含有白芨三萜有微血管生成，但是在实验组一、二和三中的微血管数目高于对照组.仅在高浓度的实验组中微血管数目低于对照组，说明高浓度白芨三萜对VEGF诱导的微血管具有抑制作用.

2.2 白芨环阿屯烷三萜对对HeLa细胞增殖的抑制作用

当白芨三萜浓度为10，20，30，40和50 μmol/mL时，对HeLa细胞无显著的抑制作用，50 μmol/mL时的抑制率为34.99%.当白芨三萜浓度达到50 μmol/mL时，HeLa细胞数量显著减少（图未示）.因此，提高白芨三萜浓度，其对HeLa细胞的抑制率如表1所示，呈现一定的浓度——剂量效应，据此分析，其IC50为61.33± 1.78 μmol/mL.

表1 不同浓度白芨三萜对HeLa细胞增殖的抑制率

2.3 白芨环阿屯烷三萜对HeLa细胞周期和细胞凋亡的影响

在本实验中，首先检测了药物对细胞周期的影响.经观察，经白芨三萜处理后有相当一部分HeLa细胞漂浮起来，而细胞周期检测实验中，只检测了贴壁的细胞，而这部分贴壁细胞往往受白芨三萜的影响较小.检测发现，当白芨三萜浓度低于50 μmol/mL时，对细胞周期无明显影响，而当白芨三萜浓度高于100μmol/mL时，Sub-G1期的细胞显著减少，而G0/G1期的细胞明显增多（表未示）.这表明，白芨三萜阻止细胞于G1期.

图2 流式细胞仪分析不同浓度白芨三萜对HeLa细胞凋亡的影响a:control；b:30 μmol/mL；c:40 μmol/mL；d:50 μmol/mL；e:100 μmol/mL；f:150 μmol/mL

HeLa细胞处理后，经过流式细胞仪分析，发现细胞分2个群组，设为A，B二个门，如图2所示，绿色的为A门，为贴壁细胞，红色的为B门，为漂浮细胞.从图中可以看出，未经处理的对照组中也存在一定数量的细胞凋亡和坏死，主要原因在于从分离和收集细胞，到上样检测经历约10 h，HeLa细胞出现了自然的凋亡和坏死现象，但加入白芨三萜后细胞凋亡和坏死的数量明显增加，晚凋亡细胞数量和坏细胞的数量增多.同时也观察到贴壁的细胞较少出现凋亡和坏死.

2.4 白芨环阿屯烷三萜诱导HeLa细胞凋亡和坏死的形态观察

如图3所示，未经处理的正常的HeLa细胞中，大部分细胞核为均匀的圆形或椭圆形，出现了少量的凋亡细胞，但是，经过200 μmol/mL白芨三萜溶液处理HeLa细胞17 h后，绝大部分均匀的圆形或椭圆形细胞核消失了，细胞核出现固缩现象，同时，凋亡细胞，特别是坏死细胞明显增加.

图3 显微镜观察白芨三萜对HeLa细胞形态的影响a:0 μmol/mL；b:200 μmol/mL

3 讨论

在细胞存活分析实验中，所得到的IC50基本上能反映出某种药物对细胞的抑制效应.IC50越小，对肿瘤细胞的抑制效果越好，如对于紫杉醇敏感细胞株SKOV3，如紫杉醇的IC50可达到1.17±0.03 nmol/L［8］.因而IC50是衡量药物疗效的一个重要指标.当然，在一定情况下，这种IC50可能不一定具有可比性，如药物处理细胞时，肿瘤细胞的类型，肿瘤细胞的密度和数量，药物处理的时间，以及药物的作用机理等，均会产生较大差异.在本实验中，细胞密度为2×104/mL，如果将细胞密度调整为1×104/mL，IC50可能会降低.

从本实验中，通过流式细胞仪分析发现，虽然白芨三萜可诱导HeLa细胞凋亡，但诱导的凋亡率并不高，而细胞坏死率却明显增多，这与倒置显微镜观察的结果相吻合.此外，通过观察紫杉醇处理的HeLa细胞，发现HeLa细胞保持细胞膜的完整性，而白芨三萜处理的HeLa细胞，却导致大部分的被处理的细胞的细胞膜破裂和崩溃，这说明，白芨三萜抑制HeLa细胞增殖可能主要是通过诱导细胞坏死实现的.同时，也表明白芨三萜抑制大鼠动脉环微血管生成可能是通过诱导细胞坏死途径实现的.这也很好解释了在大鼠动脉环实验中，低浓度处理的大鼠动脉环的“微血管”数目反而比对照组增多的现象（见图1），这为这些“微血管”可能不是真正的“微血管”，而是一种崩溃的细胞膜等构成的假象.

环阿屯烷三萜可与配糖基结合形成三萜糖苷，在植物中的分布没有一定的规律性，最早发现分布于升麻族植物中，也是最早用于抗肿瘤药理学研究［9］.目前，一些植物中的环阿屯烷型三萜及其糖苷也进行了抗肿瘤的药理学及其分子机理研究［10-15］.目前，环阿屯烷三萜抑制肿瘤的分子机理仍然是未解之谜.

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【责任编辑：吴跃新】

Inhibitive Effects of Cycloartane Triterpene from Bletilla striata on Angiogenesis and Tumor Cell Proliferation

LIU Ming-zhi
（School of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

This paper is to study the inhibitory effects of cycloartane triterpene from Bletilla striata on angiogenesis and tumor cell proliferation.The inhibitive effects of the triterpene on angiogenesis were observed by the rat aortic rings model. The inhibitive rates of the triterpene on HeLa cell proliferation were detected by MTT method.The influence of the triterpene on cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.50 μg/mL and 100 μg/mL of the triterpene showed remarkable inhibition effects on microvessel formation of rat aortic rings.The IC50of the triterpene on HeLa cells propagation was 61.33±1.78 μmol/mL.The triterpene could block cell mitosis in G1 phase，and have the double roles of apoptosis and necrosis by flow cytometry analysis.The triterpene from Bletilla striata had the inhibitive effects on angiogenesis and tumor cell proliferation.

Bletilla striata；cycloartane triterpene；angiogenesis；tumor cells

R965.1

A

1671-5934（2016）06-0031-04

2016-10-10

广东省教育厅人才基金项目（A411.0202）；惠州学院新进博士教授资助项目（C511.0202）

刘明志（1963-），男，教授，湖南岳阳人，研究方向为分子细胞生物学及天然小分子的药理学.