基于系统生物学和合成生物学的重要平台化学品生物制造的研究进展

袁海波，李江华，刘龙，堵国成，陈坚

（江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）



基于系统生物学和合成生物学的重要平台化学品生物制造的研究进展

袁海波，李江华，刘龙，堵国成，陈坚

（江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

摘要：基于生物质资源的平台化学品制造，是解决目前石化资源枯竭和环境问题的重要措施，对经济社会的可持续发展具有重要意义。本文主要介绍了系统生物学和合成生物学在有机酸（琥珀酸、富马酸、L-苹果酸、葡萄糖二酸、丙酮酸、苯丙酮酸、α-酮戊二酸）以及其他平台化学品（2,5-呋喃二甲酸）生物制造中的应用，并展望了生物制造在平台化学品生产中的未来发展方向。

关键词：系统生物学；合成生物学；生物催化；生物技术；平台化合物；生物制造

2015-07-01收到初稿，2015-08-16收到修改稿。

联系人：陈坚。第一作者：袁海波（1991—），男，博士研究生。

Received date: 2015-07-01.

引 言

近年来，随着人们对环境问题的日益关注以及全球石化资源供给的日趋紧张，生物制造在环境保护、生物能源以及生物基材料的开发等领域正受到人们越来越多的关注[1-3]。生物基材料的开发是生物制造的一项重要内容，它是以可再生的生物质资源为原料，利用微生物细胞或酶的催化功能来生产多种高附加值平台化合物，这些化合物可经进一步加工或者直接使用来生产多种高附加值化工产品[2, 4]。2004年，美国能源部在一份名为“源自生物基质的高附加值化学品”的报告中，提出了12种未来最有价值的平台化合物，包括：琥珀酸、2,5-呋喃二甲酸、3-羟基丙酸、谷氨酸、天冬氨酸、葡萄糖二酸、衣康酸、3-羟基丁内酯、乙酰丙酸、甘油、山梨醇和木糖醇[5]，图1所示为该12种重要平台化合物的化学结构。

图1 12种重要平台化合物化学结构Fig.1 Structures of 12 top value added bio-based chemicals

图2 系统生物学和合成生物学在工业生产菌株改造中的应用Fig.2 Application of systems biology and synthetic biology in strain improvement for industrial products

近年来，系统生物学和合成生物学的快速发展，为定向改造微生物细胞生产目标化合物提供了有力的分析手段和工具，图2所示为系统生物学和合成生物学在工业生产菌株改造中的应用[6]。目前，系统生物学的发展已经可以使人们从基因组层面去研究细胞的代谢网络，包括代谢途径中的关键基因、细胞代谢的复杂调节机制以及外界环境的扰动对细胞整体代谢的影响，进而通过建立代谢模型，评价和预测可能的代谢工程操作，从而改善细胞的生理机能和生产性状。合成生物学作为综合了生物科学和工程学的崭新的研究领域，通过理性设计创建生物零件、模块和系统甚至新物种，实现对现有的天然生物系统进行改造和优化，或者设计新的生物途径或网络，实现人工生物系统的构建[7]。本文总结了系统生物学和合成生物学技术在生物基平台化学品制造领域的最新应用进展，并展望了生物制造在平台化学品生产中的未来发展方向。

1 系统生物学和合成生物学与有机酸的生物制造

有机酸（organic acids）作为一类重要的平台化学品，广泛应用于食品、医药及化工生产等领域。目前，有20多种有机酸可以采用发酵法进行生产，有机酸的发酵生产行业已经逐渐成为发酵工业的重要支柱。

1.1 琥珀酸

琥珀酸又名丁二酸（succinate），是三羧酸循环的中间代谢产物，广泛存在于人体、动植物以及微生物中[8]。琥珀酸作为一种重要的C4平台化合物，可以替代由石油衍生的化学品来合成己二酸、1,4-丁二醇、γ-丁内酯、四氢呋喃等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）等可降解生物材料[9]。

琥珀酸生产菌株种类繁多，目前研究最多的是Actinobacillus succinogenes、Anaerobiosprillum succiniciproducens、Mannheimia succiniciproducens、Corynebacterium glutamicum和重组大肠杆菌[10-12]。由于培养条件相对简单、生长迅速、遗传背景和代谢途径清楚等优点，大肠杆菌被广泛应用于琥珀酸的生产[9]。重组大肠杆菌可以通过有氧、厌氧和两阶段发酵来生产琥珀酸[13-15]。其中，两阶段发酵过程包括有氧条件下菌体的生长和厌氧条件下琥珀酸的积累。近年来，随着琥珀酸生物制造工业的快速发展，人们在大肠杆菌的代谢途径改造和发酵工艺等方面做了大量的研究。尤其是在大肠杆菌的琥珀酸代谢途径方面，如强化琥珀酸合成途径、抑制或阻断琥珀酸竞争途径或者构建琥珀酸有氧生产体系，提高琥珀酸生产强度[16]。

1.1.1 强化琥珀酸合成途径 有氧条件下，对于野生型大肠杆菌，琥珀酸仅作为三羧酸循环的中间产物，不作积累；在厌氧条件下，可以进行混合酸发酵产生少量的琥珀酸（7.8%）[17-18]。在厌氧条件下，葡萄糖先经糖酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），然后在PEP羧化酶作用下转化为草酰乙酸（OAA），进而在苹果酸脱氢酶和富马酸还原酶的作用下生成琥珀酸（代谢途径见图3）。Millard等[19]在大肠杆菌中过表达了内源性基因ppc和pck，结果表明过表达ppc可以明显提高琥珀酸的产量，而过表达pck对发酵结果没有显著影响，但是在ppc缺陷菌株中，过表达pck可以提高琥珀酸的产量。Liu等[20]通过在敲除了ldhA、pflB和ppc基因的大肠杆菌K12中过表达pck，额外提供了菌体生长所需的ATP，显著提高了生物量和琥珀酸产量。此外，Kwon等[21]进一步研究发现，只有在添加重碳酸盐的条件下，过表达PEP羧激酶才能提高琥珀酸产量。Wang等[22]和Goldberg等[23]通过在大肠杆菌中过表达富马酸还原酶，可以直接将富马酸转化为琥珀酸，且转化率达到93%。

图3 大肠杆菌中琥珀酸合成途径Fig.3 Central metabolic pathways related to succincate formation in E. coli

目前，很多研究者通过在大肠杆菌中引入外源的关键酶基因，来提高琥珀酸产量及生产强度。Kim 等[24]通过引入产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes的pck基因，使琥珀酸产量较出发菌株提高了6.5倍，与过表达内源性pck基因相比，效果显著。Lin等[25]通过引入Sorghum vulgare中的ppc基因以及Lactococcus lactis中的丙酮酸羧化酶基因pyc，琥珀酸的产量大大提高，且乳酸、乙酸含量很低。Sánchez等[15]在大肠杆菌E. coli SBS550MG中引入柠檬酸合成酶基因cs，琥珀酸产量有了明显提高，琥珀酸对葡萄糖的得率为1.58 mol·mol-1。Vemuri等[26]在E. coli AFP111中引入了来自菜豆根瘤菌Rhizobium etli的pyc基因，该菌株在双阶段发酵中琥珀酸产量可以达到99.2 g·L-1，生产强度为1.3 g·L-1·h-1。Yang等[27]在E. coli ZJG13中过表达了调控乙醛酸支路的aceKBA基因，结果表明对琥珀酸的生产强度影响较小。随后，Yang等利用计算机模拟对琥珀酸生产途径中的3个羧化酶——丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和PEP羧化酶对琥珀酸产率的影响进行了分析，结果显示丙酮酸羧化酶对琥珀酸产率影响最大，这一结果在实验中得到了验证。采用补料分批发酵策略，琥珀酸的产量可以达到36.1 g·L-1，生产强度为2.75 mmol·(g DCW)-1·h-1，是目前已报道的有氧发酵中生产强度最大的菌株。

1.1.2 抑制或阻断琥珀酸竞争途径 要提高琥珀酸产量，就必须减少E. coli中混酸发酵的副产物，如甲酸、乙酸及少量乳酸等，使代谢流更多流向琥珀酸。Chatterjee等[28]通过抑制E. coli中的磷酸转移系统（PTS），使E. coli的生长和琥珀酸的产量都有所提高。Lee等[29]通过在基因组范围内比较琥珀酸高效生产菌株M. Succiniciproducens和混合酸发酵下的E. coli中琥珀酸的中心代谢途径，通过找出差异基因并对这些基因进行改造以提高E. coli发酵生产琥珀酸的产量。Lee等首先选择了E. coli中的ptsG，pykF，sdhA，mqo和aceBA 5个基因，并对它们进行了组合失活，发现该方法并不能提高琥珀酸的产量。随后，采用计算机模拟分析预测，发现敲除E. coli中与丙酮酸生成相关的3个酶——ptsG，pykF和pykA可以提高琥珀酸产量，这一结果在实验中得到了验证。Lin等[13,30]通过构建包含TCA循环氧化支路和乙醛酸循环的代谢工程菌株，有氧条件下，补料分批发酵，琥珀酸产量可以达到58.3 g·L-1，得率为0.85 mol·mol-1。Jantama等[14]以E. coli C菌株为基础，通过敲除一系列与副产物生成相关的基因，构建了菌株E. coli KJ073（ΔldhA ΔadhEΔackAΔfocAΔpflBΔmgsAΔpoxB），在矿物盐培养基中通过简单控制pH分批发酵，琥珀酸产量可以达到688 mmol·L-1，琥珀酸对葡萄糖产率为1.2 mol·mol-1，生产强度为0.82 g·L-1·h-1。

目前，利用E. coli生产琥珀酸的突出问题是生产强度相对于某些瘤胃细菌还较低[31]。比如M. succiniciproducens的琥珀酸生产强度可以达到25.28 mmol·(g DCW)-1·h-1[32]。随着系统和合成生物学的发展，人们对E. coli的生理代谢和调控机制方面的认识也会越来越清晰，进而可以通过定向改造和优化琥珀酸表达调控网络或者重构有潜力的代谢途径来提高琥珀酸生产强度。

1.2 富马酸

富马酸又名延胡索酸（fumaric acid），是一种重要的C4平台化合物。富马酸作为重要的精细化工产品和有机化工原料，广泛应用于医药、材料、化工、饲料及食品添加剂等领域[33]。同时，富马酸还可以通过酶催化、水合、氨化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、琥珀酸、苹果酸和1,4-丁二醇等C4化合物[5]。目前，工业上主要采用化学合成法和生物转化法生产富马酸。其中，化学合成法主要包括糠醛氧化法和顺酐异构法。由于化学合成法面临着化石资源的短缺和环境污染等问题，生物转化法成为富马酸产业发展和提升的有力技术支撑。

富马酸的生物合成法包括微生物发酵和酶催化转化法。酶催化转化一般是用马来酸异构酶催化马来酸生成富马酸。微生物发酵法主要是利用根霉菌、酿酒酵母和工程大肠杆菌发酵生产富马酸[33-35]。

真菌是包括富马酸在内的有机酸生产的主要菌株，其中根霉菌Rhizopus species的富马酸产生能力较强，由于其环境适应能力强、易培养以及生长迅速等优点，使其成为了主要研究对象，主要包括少根根霉Rhizopus arrhizus和米根霉Rhizopus oryzae等。Osmani等[36]提出的关于富马酸在根霉菌中积累的“胞液途径”学说，是目前被认同的主流观点。他们认为在少根根霉Rhizopus arrhizus的胞液中存在着TCA还原途径，丙酮酸羧化酶是该途径中的关键酶之一，它催化丙酮酸固定CO2生成草酰乙酸，然后草酰乙酸在苹果酸脱氢酶和富马酸酶的作用下生成富马酸。Kenealy等[37]证实了该途径是R. arrhizus中富马酸生成的主要途径，而TCA循环的作用主要是为菌体生长提供ATP和中间代谢物。Wright等[38]通过14C同位素标记得到了葡萄糖的代谢模型，证明了R. oryzae中存在两个独立的丙酮酸代谢池，一个位于胞液中用于合成富马酸、乳酸及乙醇等，另外一个位于线粒体用于TCA循环。由于富马酸酶在胞液途径富马酸的生成中的重要作用，Zhang等[39]在米根霉中表达了富马酸酶基因fumR，结果显示单纯过表达富马酸酶并不能提高富马酸产量，因为富马酸酶也可以催化富马酸生成苹果酸，因而L-苹果酸产量反而有所提高。

近年来，研究者们也尝试采用基因工程手段在酿酒酵母和大肠杆菌中重构富马酸的代谢途径。Kaclíková等[40]通过对酿酒酵母中的线粒体富马酸酶进行突变失活，以葡萄糖为底物，富马酸的产量约为0.5 g·L-1。吴世根等通过在毕赤酵母GS115中过表达丙酮酸羧化酶胞质同工酶，结果表明该酶的表达有助于草酰乙酸和L-苹果酸的积累，富马酸的产量仅有少量增加。Xu等[34]通过在酿酒酵母中表达来自米根霉的苹果酸脱氢酶基因、富马酸酶基因以及酿酒酵母自身的丙酮酸羧化酶基因，实现了富马酸的积累，但是产量仅有3.18 g·L-1。Song等[35]通过敲除大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子基因iclR、富马酸酶基因fumABC、葡萄糖特异性转运蛋白ⅡCBGlc基因ptsG和天冬氨酸酶基因aspA，并且过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，补料分批发酵63 h后，富马酸的产量和生产强度分别达到了28.2 g·L-1和0.448 g·L-1·h-1。

1.3 L-苹果酸

L-苹果酸（L-malic acid）是生物体中三羧酸循环及其支路乙醛酸循环的中间代谢产物。作为一种重要的C4化合物，L-苹果酸被广泛应用于食品、医药和化工领域[41]。

L-苹果酸的生物合成法主要有3种：第1种是直接发酵法，使用霉菌（米曲霉、黄曲霉及寄生曲霉等）以糖类为原料直接发酵生产L-苹果酸；第2种是混合发酵，首先利用根霉菌将糖类转化为富马酸，然后再利用酵母将富马酸转化成L-苹果酸；第3种是酶催化转化，利用微生物的富马酸酶直接将富马酸转化为L-苹果酸。已有研究表明，曲霉等微生物生成L-苹果酸的主要途径是丙酮酸羧化支路途径，即丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下固定CO2生成草酰乙酸，然后在苹果酸脱氢酶作用下生成L-苹果酸[42-43]。

目前，采用系统生物学及合成生物学手段来改造和构建L-苹果酸生产菌株已成为苹果酸高产菌株育种的主要研究方向。Zhang等[44]在生产琥珀酸的大肠杆菌（KJ060和KJ073）的基础上敲除了富马酸还原酶基因frdBC、苹果酸酶基因sfcA和maeB以及富马酸同功酶基因fumB和fumAC，构建了工程菌XZ658（KJ073∆frdBC∆sfcA∆maeB∆fumB∆fumAC）。该菌株在双阶段发酵下，72 h后L-苹果酸产量可以达到253 mmol·L-1，糖酸转化率为1.42 mol·mol-1，生产强度为0.47 g·L-1·h-1。Mu等[45]首次采用合成生物学手段将大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和酿酒酵母中苹果酸脱氢酶引入到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，成功构建了一条L-苹果酸的异源生物合成途径。该工程菌在进一步敲除乳酸脱氢酶基因后，采用两阶段发酵可以实现L-苹果酸的积累，最大产量为(15.65±0.13)mmol·L-1。Zelle等[46]在丙酮酸脱羧酶缺陷型的酿酒酵母中过表达苹果酸脱氢酶MDH3的等位基因、内源性丙酮酸羧化酶基因和苹果酸转运蛋白基因SpMAE1，分批培养下，L-苹果酸产量达到59 g·L-1，糖酸转化率为0.42 mol·mol-1。Oba等[47]从清酒醪中分离到一株高产苹果酸的酿酒酵母，通过基因芯片技术比较该菌株和原始菌株的基因表达水平时发现，L-苹果酸高产菌株中的应激反应基因如HSP12出现上调，而硫胺素合成基因THI4和SNZ2出现下调，此研究为今后代谢改造酿酒酵母生产L-苹果酸提供了研究方向。

1.4 葡萄糖二酸

葡萄糖二酸（D-glucaric acid, GA）是一种天然存在于樱桃、柑橘等水果和十字花科蔬菜中的无毒化合物，也少量存在于包括人类的哺乳类动物中[48-50]。葡萄糖二酸在糖尿病、癌症的治疗和降低胆固醇方面也有广泛应用[49, 51-52]。葡萄糖二酸及其酯还可作为合成羟基化的尼龙和超支化聚酯的起始单体原料，具有巨大的应用潜力[5]。

目前，化学氧化法是制备葡萄糖二酸的主要方法，通过氧化D-葡萄糖来生产D-葡萄糖二酸，如硝酸氧化和以2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物（TEMPO）为介导的氧化[53-55]。微生物发酵法作为一种更为经济、环保的方法越来越受到研究者的青睐。

葡萄糖二酸作为哺乳动物体内的代谢终产物，以葡萄糖为底物需要经过10步以上的反应才可以得到[49]。Marsh[56]用小鼠腺体中提取纯化的葡萄糖醛酸酶，以葡萄糖醛酸为底物，在Fe2+和H2O2存在的条件下，可以得到葡萄糖二酸。目前，并没有微生物存在从葡萄糖到葡萄糖二酸的完整的天然合成途径的报道。

Moon等[57]首次用合成生物学的方法在E. coli中构建了一条葡萄糖二酸的合成途径，成功实现了由葡萄糖到葡萄糖二酸的生物制备。研究者通过在E. coli中共表达了3个外源基因——酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，小鼠的肌醇氧化酶基因MIOX以及丁香假单胞菌Pseudomonas syringae中的糖醛酸脱氢酶基因Udh，构建了一条葡萄糖二酸的生物合成途径。进一步研究发现，该途径中催化肌醇转化为葡萄糖醛酸的MIOX是限速酶，其活性受到底物肌醇浓度的直接影响。为了增大肌醇的有效浓度，从而提高葡萄糖二酸的产量，Moon等[58]依据蛋白之间的相互作用构建了多肽支架，将途径中的3种酶组成蛋白复合体，提高了物质流的利用效率，使葡萄糖二酸的产量提高了5倍，达到2.5 g·L-1。随后，Shiue 等[59]通过在MIOX的N端融合表达了SUMO（小泛素相关修饰物）标签以及提高肌醇的转运速率，以肌醇为底物，使葡萄糖二酸的产量提高至4.85 g·L-1。Shiue等在研究中发现，以肌醇为底物生产葡萄糖二酸时，存在产物抑制现象，葡萄糖二酸的产量无法超过5 g·L-1，这种现象可能是由于产物葡萄糖二酸的积累导致体系pH过低，从而引起细胞正常的生理和代谢机能发生变化[59-60]。Konishi 等[61]通过使用不同来源的Ino1、MIOX和Udh在大肠杆菌中构建了葡萄糖二酸的合成途径，添加并且强化了Ino1，通过控制培养基中葡萄糖的浓度和采取补料分批发酵策略，葡萄糖二酸的产量可以达到73 g·L-1。

1.5 丙酮酸

丙酮酸（pyruvate）是生物体中重要的中间代谢产物，被广泛应用于制药、化工、农用化学品和保健品等行业。目前，丙酮酸的化学合成法主要有酒石酸法、乳酸催化氧化法、羟基丙酮法和电化学法等；生物合成法主要包括生物催化转化法和直接发酵法。

早在20世纪50年代，就有学者对发酵法生产丙酮酸开始了研究。1989年，日本学者Miyata和Yonehara选育出了多种丙酮酸产量可以超过50 g·L-1的球拟酵母（Torulopsis）。其中，光滑球拟酵母Torulopsis glabrata是工业化生产上也是目前研究较多的菌株。丙酮酸作为糖酵解的最终产物，处于生物体内代谢的关键节点，很容易代谢生成其他产物，不易积累。要实现丙酮酸的大量积累，就需要弱化或切断丙酮酸的进一步代谢。日本学者Yonehara和Yokota分别对多重维生素营养缺陷型球拟酵母和能量代谢有缺陷的大肠杆菌进行了研究，获得了一株丙酮酸生产能力良好的多重维生素营养缺陷型T. glabrata IFO0005，正常培养条件下，丙酮酸对葡萄糖的产率为0.41 g·g-1。对该菌株通过诱变处理后，增加了一系列遗传标记（如L-精氨酸营养缺陷型、L-异亮氨酸和L-缬氨酸营养缺陷型等），其丙酮酸产率可以达到0.54 g·g-1。李寅等[62]考察了T. glabrata WSH-IP303菌株在葡萄糖为碳源、氯化铵为唯一氮源的培养基中，不同维生素对丙酮酸产量的影响，分批发酵57.5 h后，丙酮酸的产量和产率分别达到了69.4 g·L-1和0.593 g·g-1。丙酮酸在多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata中的积累，被认为是由于以硫胺素为辅因子的丙酮酸脱氢酶系PDH受损，导致丙酮酸氧化脱羧减少造成的。

除了筛选营养缺陷型菌株用于丙酮酸的生产外，借助生化工程方法和代谢工程策略，综合运用定量PCR（qPCR）、表达谱芯片、代谢物分析和关键酶活性分析等系统生物学手段来研究胞内NADH和ATP的代谢控制方式，也是提高T. glabrata丙酮酸生产效率的有效手段。Hua等通过代谢分析研究了不同溶氧浓度对丙酮酸发酵的影响，发现不同溶氧水平对能量代谢和关键代谢途径的影响是不同的。当溶氧为30%～40%时，丙酮酸的产率提高了15%，且副产物乙醇的生成量减少。Li等[63]通过考察分批发酵中不同的体积溶氧系数对丙酮酸发酵的影响，结果表明分阶段控氧比恒定KLa的丙酮酸生产强度有大幅度提高。通过代谢分析可知，抑制氧化磷酸化途径中ATP的生成是提高丙酮酸生产强度的有效措施。刘立明等[64-65]通过选育T. glabrata的呼吸缺陷型突变株，削弱了氧化磷酸化的活性，提高了糖酵解速度，丙酮酸的生产强度也得到提高。由于细胞内NADH/NAD+的水平也会直接影响ATP的水平，刘立明等通过加入电子传递链抑制剂（抗霉素A和鱼藤酮）和FoF1-ATPase抑制剂（寡霉素）或选育新霉素抗性菌株，达到了提高丙酮酸产量的目的。此外，Liu等[66]用高渗透条件筛选到一株可以耐受70 g·L-1NaCl的菌株T. glabrata RS23。此菌株以葡萄糖为碳源，丙酮酸产量和产率可以达到94.3 g·L-1和0.635 g·g-1。Wang 等[67]通过DNA重组技术敲除了T. glabrata中的丙酮酸脱羧酶PDC，减少了发酵过程中副产物乙醇的产生，丙酮酸产量可以达到82.2 g·L-1。Zelić等[68]构建了一株重组大肠杆菌E. coli YYC202 ldhA::Kan，该菌株丧失了丙酮酸转化为乙酰辅酶A、醋酸和乳酸的能力，利用该菌株发酵生产丙酮酸产率可以达到0.54 g·g-1。

1.6 α-苯丙酮酸

α-苯丙酮酸（phenylpyruvic acid, PPA）是一种双羰基化合物，广泛应用于医药、食品和化工生产等领域[69]。PPA是合成D-苯丙氨酸的前体，而D-苯丙氨酸可以用来生产手性药物和食品添加剂[70]。此外，PPA还可以用来生产苯乳酸和阿斯巴甜等。

目前，PPA的生产主要是化学合成法和生物转化法。化学法主要有海因法、双羰基化法和α-乙酰氨基肉桂酸水解法等。相对于化学合成法，生物转化法具有环境污染小、生产成本低以及产物安全性高等优点，正受到人们的广泛关注。

PPA的生物转化法主要包括微生物发酵法和酶转化法。但是由于发酵法的PPA产量较低（1.05 g·L-1），因此目前研究较多的是酶转化法[71]。酶转化法是通过L/D-氨基酸脱氨酶（LAAO/DAAO）催化L/D-苯丙氨酸脱氨基生成。但是由于D-苯丙氨酸价格较高以及DAAO催化过程产生的双氧水对转化的不利影响，因此目前主要采用非双氧水生成型的LAAO进行PPA的生产。LAAO广泛存在于蛇毒、真菌、细菌、藻类及动物中。其中，来源于普通变形杆菌Proteus vulgaris、奇异变形杆菌Proteus mirabilis、雷特格氏变形杆菌Proteus rettgeri、魔氏变形杆菌Proteus morganii以及普罗维登斯菌属Providence的菌株因具有苯丙氨酸脱氨酶而被广泛研究[72]。

有研究者在E. coli BL21（DE3）中表达了来源于P. mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因pma，在最优条件下，以浓度为14 g·L-1的L-苯丙氨酸为底物，PPA的产量可以达到6.2 g·L-1，转化率为44.6%。随后，利用易错PCR对该脱氨酶进行定向进化并且敲除了E. coli中与L-苯丙氨酸进一步代谢有关的基因，最终PPA的产量和转化率分别达到了11.5 g·L-1和82%[73]。

1.7 α-酮戊二酸

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）作为三羧酸循环（TCA 循环）中重要的中间代谢产物，参与体内氨基酸、糖类以及脂肪代谢等多种代谢过程。因此，α-酮戊二酸被广泛应用于食品、医疗以及化工生产等领域[74]。目前，工业上生产α-酮戊二酸主要采用的是化学合成法，但是化学合成过程中使用的氰化物和重金属离子等有毒试剂，限制了α-酮戊二酸在食品和医疗等领域的应用。因此，生物法成为了生产α-酮戊二酸的最佳选择。

目前，人们已经发现了多种可以过量积累α-KG的微生物，包括多种原核微生物和真核微生物[75-77]。由于真核微生物相对于原核微生物来说，能耐受更低的pH条件，更适合发酵生产短链有机酸[78]，因此目前研究的生产α-KG的菌株多以真核微生物为主。其中，解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica因其生长迅速、生理特征清晰、底物谱宽和安全性等优点，越来越受到人们的重视[79]。

由于α-KG在三羧酸循环中处于关键位置，并且连接着碳-氮代谢，参与细胞内多种调控过程，因此采取基于代谢组学的系统生物学手段对微生物积累α-KG的过程进行系统分析，对于揭示微生物的代谢机理和实现α-KG的过量积累具有重要的意义。α-KG生产菌株在积累α-KG的过程中，存在两个重要的代谢节点：一是丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系PDHC作用下生成乙酰辅酶A，然后进入TCA循环；二是α-酮戊二酸脱氢酶系KGDH催化的α-KG的进一步代谢。硫胺素作为PDHC和KGDH的辅因子，是α-KG积累的关键因素。Chernyavskaya等[80]对硫胺素营养缺陷型菌株Y. lipolytica N1在不同硫胺素浓度、氮源、pH和溶氧下α-KG的产量进行了研究，结果显示亚适量硫胺素和过量氮源是积累α-KG的必要条件，在最佳条件下α-KG的产量可以达到49.0 g·L-1，对乙醇产率为42%。紧接着，Il’chenko等[81]对Y. lipolytica N1菌株中心代谢途径中关键酶的活性进行了研究，结果显示在积累α-KG阶段，KGDH和柠檬酸合酶活性较低，而依赖于NADPH的异柠檬酸脱氢酶具有较高活性。为了提高α-KG的产量，基于增大流向目标产物的代谢流和减弱目标产物的进一步代谢的代谢工程改造是较为有效的手段。为了增大流向目标产物的代谢流，Foerster等[82]在Y. lipolytica H222中过表达了异柠檬酸裂解酶ICL1，实现了菌体在总产酸不变的情况下，异柠檬酸占总酸比例的显著下降。随后，Holz等[83]通过表达顺乌头酸酶ACO1，使异柠檬酸占总酸的比例由35%～49%提高到66%～71%。Yin等[84]在Y. lipolytica WSH-Z06中分别过表达了来自酿酒酵母和米根霉的丙酮酸羧化酶PYC，重组菌株的α-KG产量分别提高了24.5%和35.3%，在3 L发酵罐上的产量可以达到69.2 g·L-1。此外，通过削弱α-KG的进一步代谢是提高α-KG产量的另一策略。Verseck等敲除了C. glutmicum菌株的谷氨酸脱氢酶基因gdh，使得α-KG在发酵液中的浓度达到5 g·L-1。Holz 等[85]在研究KGDH对Y. lipolytica的产酸影响时，利用生物信息学技术，将Y. lipolytica与S. cerevisiae 中KGDH的3个基因（ScKGD1，KGD2，LPD1）进行了比较分析，找到了Y. lipolytica中的3个相应基因YlKGD1，YlKGD2和YlLPD1，并将这3个基因在Y. lipolytica中进行过量表达。发酵结果显示，α-KG的产量从原始菌中的97 g·L-1下降到重组菌中的72 g·L-1，而丙酮酸含量有所提高。

虽然在微生物代谢生产α-KG的机制及代谢工程改造方面已经取得一定成果，但是依然存在着过量积累α-KG机制不清楚以及代谢副产物过多等问题。

1.8 2,5-呋喃二甲酸

2,5-呋喃二甲酸（2,5-furandicarboxylic acid, FDCA）作为一种重要的化工原料及有机合成中间体，广泛应用在医药、抗菌剂和高分子材料的合成中[86-87]。此外，由于2,5-呋喃二甲酸的结构和性质与对苯二甲酸相似，可以作为其替代品用于聚酯类材料的制造[88-90]。

2,5-呋喃二甲酸可以由5-羟甲基糠醛（HMF）氧化生成，而5-羟甲基糠醛可以由葡萄糖或果糖脱水而成。目前，对于FDCA的生产，主要是化学合成法。FDCA的化学合成需要高压、高温、有机溶剂和金属离子催化，致使整个生产工艺高成本和高污染，不利于实际生产应用[91-93]。与化学催化不同的是，生物（酶或全细胞）催化可以在相对温和的条件下进行，可以显著降低生产成本和有害物质的排放[94]。然而，目前用生物催化法生产FDCA的研究还处于初始阶段，已报到的文献中只有极少的酶可以氧化HMF生成FDCA。其中来源于Caldariomyces fumago的氯过氧化物酶可以氧化HMF，生成74%的2,5-呋喃二甲醛和20%的5-羟甲基-2-呋喃甲酸，但是不能生成FDCA[95]。近年来，Koopman等[96]通过转座子突变筛选鉴定出了贪铜菌Cupriavidus basilensis HMF14中的HMF和呋喃甲醛的代谢途径，证实了5-羟甲基糠醛氧化还原酶（HmfH）可以将5-羟甲基糠醛氧化为2,5-呋喃二甲酸。随后，Koopman等[97]在恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S12中异源表达了HmfH，以甘油为碳源，补料分批培养，可以得到30.1 g·L-1的FDCA，产率为97%。该恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S12自身只能催化HMF生成5-羟甲基-2-呋喃甲酸，只有表达了来源于贪铜菌Cupriavidus basilensis HMF14中的HmfH基因后，才可以催化HMF生成FDCA。随后，Dijkman等[98-99]在大肠杆菌中表达了来源于甲基营养菌Methylovorus sp. strain MP688的5-羟甲基糠醛氧化酶（HMFO），该酶不仅可以将HMF氧化为FDCA，而且还可以氧化芳香族醇类和醛类物质，该酶可以在24 h内将95%的HMF转化为FDCA。

虽然人们对5-羟甲基糠醛氧化酶研究还处于起始阶段，但生物催化仍是未来2,5-呋喃二甲酸生产的重要研究方向。

2 展 望

系统生物学和合成生物学的飞速发展，为理性改造微生物提供了技术手段。系统生物学的发展使人们能够从整体水平上来理解和把握微生物的生理、代谢和功能，有助于识别代谢途径中的关键靶基因，从而对其进行代谢工程操作。另外，关于目标代谢途径和表达宿主的系统生物学研究也为合成生物学的开展提供了重要的参考。

生物制造离不开生物细胞转化技术，即利用微生物细胞或酶将底物转化为目标产物的过程。微生物转化技术在平台化学品如葡糖糖二酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等有机酸的生产中已展现出良好的应用前景。尽管我国在有机酸制造工业取得了显著成绩，但是总体技术仍低于国际同期水平，特别是在转化率、物耗和能耗以及产品质量等产业化指标方面仍明显落后于国际先进水平。因此，通过系统改造微生物代谢过程，构建高效的生物合成途径，是提高微生物转化水平的重要途径，也是推动生物制造业可持续发展的重要举措。

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Foundation item: supported by the National Basic Research Program of China (2012CB720802, 2013CB733602) and the National Natural Science Foundation of China (21390204).

Advances in production of important platform chemicals by bio-manufacturing based on systems biology and synthetic biology

YUAN Haibo, LI Jianghua, LIU Long, DU Guocheng, CHEN Jian
(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Abstract:Due to the limited amount of fossil fuels and global warming problem, bio-manufacturing based on renewable biomass has been paid more attention. In this review, the contribution of systems biology and synthetic biology in bio-manufacture of platform chemicals like organic acid such as succinate, fumarate, malate, glucaric acid, pyruvate, phenylpyruvic acid, α-ketoglutarate and other platform chemicals such as 2,5-furandicarboxylic acid are reviewed. Finally, the trends of bio-manufacture for platform chemical are prospected.

Key words：systems biology；synthetic biology；biocatalysis；biotechnology；platform chemical；bio-manufacture

Corresponding author:Prof. CHEN Jian, jchen@jiangnan.edu.cn

基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（2012CB720802，2013CB733602）；国家自然科学基金项目（21390204）。

中图分类号：Q 815

文献标志码：A

文章编号：0438—1157（2016）01—0129—11

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151042