基于消耗碳氮比进行底物分配和油脂得率预测

沈宏伟，杨晓兵，龚志伟，靳国杰，赵宗保

（中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连116023）



基于消耗碳氮比进行底物分配和油脂得率预测

沈宏伟，杨晓兵，龚志伟，靳国杰，赵宗保

（中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连116023）

摘要：微生物油脂作为胞内代谢产物，其脂肪酸组成和植物油类似，是生物柴油和油脂工业理想替代原料。为了进一步了解底物中碳氮比对油脂合成的影响，通过恒化培养的方法，研究了圆红冬孢酵母在不同稀释率条件下，消耗碳氮比和底物在油脂和非油生物量之间的分配以及和油脂得率之间的关系。通过碳、氢、氧和氮的化学反应计量学分析，并根据不同稀释率稳态时所消耗C/N比，构建了底物碳在油脂和非油生物量之间的分配模型。利用实验数据确定了模型参数：最大油脂碳得率，最大菌体碳得率为0.52 mol C·(mol C)-1，促使油脂合成的临界C/N比为12.1 mol C·(mol C)-1。利用该分配模型预测不同消耗C/N比的油脂得率，预测值为实验值的 95.2%～116.7%，表明模型可靠性较好。

关键词：发酵；生物过程；模型；参数估值；碳氮比；微生物油脂

2015-04-13收到初稿，2015-06-05收到修改稿。

联系人：赵宗保。第一作者：沈宏伟（1976—），男，博士，助理研究员。

Received date: 2015-04-13.

引 言

一些产油微生物在营养成分限制和碳源过量的条件下，将过量碳源转化合成甘油三酯，并储存在细胞内部，这些油脂被称为微生物油脂，也称单细胞油脂[1]。大部分微生物油脂的脂肪酸组成和植物油类似，主要为十六碳和十八碳脂肪酸，是生物柴油潜在的理想替代原料。微生物油脂生产具有周期短，不受时间、地点等条件的限制，底物利用范围广等优点[2]。目前，国内外的研究人员已经对微生物油脂生产进行了大量研究。

氮[3-5]、磷[6]和硫[7]等限制均可促进油脂积累，特别是在氮源限制下胞内油脂含量可超过细胞干重的70%[8]，并且油脂得率最大[9-11]。碳氮比是决定油脂含量和生物量的一个关键因素。一些研究表明：提高培养基中碳氮比，有利于提高胞内油脂含量[12-13]；在氮源限制条件下，油脂产量和生物量均随着碳氮比增大而提高，但是在初始碳氮比非常高的培养基中，培养后期仍会有一些底物不能够被利用[14]。研究也表明：葡萄糖浓度不变，通过改变氮源浓度来调节碳氮比，随着碳氮比增大，油脂得率逐渐增加达到最大值，然后随着碳氮比进一步增大，油脂得率会有轻微下降[15]。

碳氮比对油脂合成至关重要，而且碳源和氮源便于监测分析。研究碳氮比和油脂得率之间关系，对进一步认识和理解油脂生产过程，以及提高油脂生产过程经济性具有重要意义。Ykema等[16]在考虑中间代谢产物的情况下构建油脂发酵过程经济性评价模型，Granger等[17]通过对实验结果分析，利用数学方法构建了预测脂肪含量和得率的数学模型。然而模型过于复杂，且在模型中没有考虑氮源对细胞得率随胞内油脂含量的变化而变化。圆红冬孢酵母在油脂合成的研究中被广泛使用，它具有油脂含量高[8]、对木质纤维素水解副产物抗逆性好[18]、底物利用宽泛[19-21]等优点。并且已完成基因组学、转录组学和蛋白质组学分析[22]。因此，本文以圆红冬孢酵母为模式菌株，通过对碳、氢、氧和氮的化学计量学分析，并采用恒化培养的方法，研究不同稀释率稳态时消耗碳氮比和底物碳在非油菌体和油脂之间的分配关系，并对不同消耗碳比时的油脂得率进行预测，希望通过本研究能够进一步加深对微生物油脂合成过程的理解，为油脂发酵过程的调控提供参考。

1 实验材料和方法

1.1 供试菌株

圆红冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides AS2.1389）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 培养基

YEPD液体培养基（g·L-1）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，培养基初始pH用1 mol·L-1NaOH调至6.0。固体培养基在YEPD液体培养基基础上加入20 g·L-1琼脂粉。

合成培养基（g·L-1）：葡萄糖 18，硫酸铵 5，磷酸二氢钾 1.0，磷酸氢二钠1.0，七水硫酸镁 1.5，10 ml的微量元素母液。

微量元素母液（g·L-1）：氯化钙 4.0，硫酸亚铁 0.55，硫酸锌 0.10，硫酸锰 0.076 和 0.1 ml 18 mol·L-1硫酸。合成培养基和微量元素分别在121℃灭菌18 min，冷却到室温后混合在一起。

限氮培养基（g·L-1）：葡萄糖 36，硫酸铵 1，磷酸二氢钾 1.0，磷酸氢二钠1.0，七水硫酸镁 1.5，10 ml的微量元素母液。

1.3 培养方法

种子液培养：将新鲜斜面圆红冬孢酵母接种于50 ml YEPD液体培养基中，于30℃、200 r·min-1摇床上培养，培养24 h后，取20 ml转接到180 ml YEPD液体培养基中，培养24 h。

批式培养：将培养24 h种子接种装有1.8 L合成培养基的3 L发酵罐（上海保兴3-BG）中，接种量为10%，接种后体积为2 L。培养温度30℃，pH通过自动补加2 mol·L-1NaOH控制在5.6，通气量0.8 vvm，发酵时调整搅拌转数控制溶解氧在40%以上。

恒化培养：将培养到对数后期的批式培养通过补加限氮培养基开始恒化培养。工作体积1.85 L，搅拌500 r·min-1，培养温度30℃，pH通过自动补加2 mol·L-1NaOH控制在5.6，通气量0.8 vvm，发酵时调整搅拌转数控制溶解氧在40%以上。调整稀释率后连续流加5个工作体积，12 h内溶氧的波动小于3%（发酵系统内溶氧波动小于3%），则假设培养进入稳态[23]。在每个稳态下每间隔3 h在溢流口取样，共获得4个样品，每个样品40 ml。恒化培养稀释率：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 和0.14 h-1。

1.4 分析方法

（1）菌体生物量测定：使用50 ml的离心管于冰水浴中收集一定量的发酵液，取样后立即在6200g、4℃下离心5 min，将所得的含油菌体用去离子水清洗两次，然后在105 ºC下烘干至恒重，冷却后称重，差值法计算生物量。

（2）菌体油脂抽提：将烘干至恒重的菌体，按比例加入4 mol·L-1的盐酸 （按照1 g菌体加入浓度为4 mol·L-1的盐酸6 ml计算），在78℃水浴摇床中，200 r·min-1下消化1.5～2 h，然后加入与盐酸等体积的三氯甲烷和甲醇，充分振荡后，在6200g下离心5 min，抽取三氯甲烷相，再加入等体积三氯甲烷提取一次。将两次所得的三氯甲烷相合并，用等体积0.1%的氯化钠溶液洗涤后，抽取三氯甲烷相，用无水硫酸钠过滤，最后旋转蒸发去除三氯甲烷，将所得的油脂于105℃过夜称重，差值法计算油脂。油脂含量为油脂占生物量的质量百分比[19]。

（3）非油生物量测定：采用差值测定，生物量减去油脂量。

（4）残糖测定：采用山东省科学院生产的SBA-50B生物传感分析仪。

（5）残氮测定：凯氏定氮法。

（6）元素分析：采用Elementar Vario EL 3元素分析仪，热解段温度为850℃，燃烧段温度为1150℃，所有样品均为直接分析，分析两次，氧的含量为差值法获得。

1.5 模型构建

在产油微生物培养中，根据碳、氮、氢、氧元素的计量学平衡关系，且假设在产油微生物的培养过程中除油脂、菌体和二氧化碳外，其他产物可忽略不计。构建如下等式

根据碳元素平衡有

假设消耗的底物全部用来生成菌体，而没有用于油脂合成，则此时底物对菌体的得率为最大得率，表示为。假设消耗的底物全部用于合成油脂，而没有菌体生成，则此时底物对油脂的得率为最大得率，表示为。则

或

假设产油酵母在产油和非产油条件下细胞组成不变，即h、i和j均为定值，且在氮源刚好完全被消耗时没有油脂积累，定义此时所消耗的碳氮比（mol·mol-1）为临界碳氮比 ，则式（4）可转化为

因此，油脂对底物油脂得率系数为

2 实验结果与讨论

图1 圆红冬孢酵母连续培养中稀释率和消耗碳氮比之间的关系Fig.1 Relationship of D and consumed C/N in R. toruloides AS 2.1389 under continuous cultivation

2.1 圆红冬孢酵母连续培养中稀释率和消耗碳氮比之间的关系

圆红冬孢酵母在限制氮源的连续培养中，由于稀释率不同，营养物质在生物反应器中停留时间也有所不同，这导致单位时间内微生物消耗碳氮比也存在较大差别。结果如图1(a)所示。在0.02～0.14 h-1之间，随着稀释率增大所消耗碳氮比呈现逐渐下降趋势。在稀释率增大初期，细胞所消耗碳氮比下降较快，稀释率为0.02 h-1时细胞所消耗碳氮比为61.6 mol·mol-1，当稀释率增大到0.04 h-1时，下降到38.0 mol·mol-1左右，稀释率进一步增大到0.06 h-1和0.08 h-1时，所消耗碳氮比分别为30.8 mol·mol-1和24.9 mol·mol-1。而后随着稀释率进一步增大，消耗碳氮比下降趋势明显变缓，当稀释率增大到0.14 h-1时，消耗碳氮比为13.2 mol·mol-1。而且稀释率和消耗碳氮比的倒数呈线性关系（R2=0.98），结果如图1(b)所示。这和Ykema等[16]在产油酵母Apiotrichum curvature中的结果一致。

随着稀释率增大，消耗的碳氮比和胞内油脂逐渐减少。当稀释率增大到刚好胞内没有油脂积累，此时消耗的碳氮比为临界碳氮比。进一步增大稀释率，细胞元素组成不变，则消耗的碳氮比不再变化。本文2.3节中表明临界碳氮比为12.1 mol·mol-1。根据图1(b)消耗碳氮比的倒数和稀释率的线性关系可得：当消耗碳氮比为12.1 mol·mol-1时，稀释率为0.155 h-1，即稀释率大于0.155 h-1消耗碳氮比不变。

圆红冬孢酵母连续培养过程中，在不同稀释率下均达到稳态，而且不同稳态时氮源均为限制性因素，碳源相对充足。此时，所消耗碳氮比主要取决于消耗碳源数量。在低稀释率下，营养物质在反应器中停留时间长，碳有充足的时间被微生物所利用。高稀释率时停留时间短，微生物没有充足的时间消耗碳源。稀释率为0.02 h-1时，营养物质在反应器中的停留时间为50 h，而当稀释率增大到0.10 h-1时，停留时间为10 h，稀释率进一步增大到0.14 h-1时，停留时间仅为7.1 h。因此，稀释率越小所消耗碳氮比越大，反之，则越小。

2.2 连续培养中菌体（不含油脂）碳得率和油脂碳得率的计算

在氮源限制的圆红冬孢酵母连续培养中，获得了稀释率和消耗碳氮比之间的关系。消耗碳氮比不同直接导致胞内油脂含量不同，进而改变了底物碳在菌体和油脂之间的分配关系。根据Dekkers等[24]在厌氧和耗氧条件下对酿酒酵母的研究，酵母平均分子量为25 g·(mol C)-1。因此，这里不含油脂的圆红冬孢酵母分子量取25 g·(mol C)-1。酵母油脂的生产中脂肪酸组成主要包括肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸[1]。这里油脂以三油酸甘油酯计算其分子量，其分子式为C57H104O6，最简分子式的分子量约为15.6 g·(mol C)-1。

表1 圆红冬孢酵母恒化培养中菌体中碳和油脂中碳Table 1 Values of CXf C-and CL C-of R. toruloides AS 2.1389 in continuous culture under nitrogen limitation

图2 圆红冬孢酵母连续培养中消耗碳氮比和YX、YL之间的关系Fig.2 Relationship between consumed C/N and YXand YLof R. toruloides AS 2.1389 in continuous cultivation

圆红冬孢酵母在氮源限制连续培养中，非油生物量和油脂碳结果如表1所示。油脂和非油生物量中碳均随着稀释率增大而下降，但油脂中碳下降更快，这与油脂量和非油生物量随稀释率变化趋势相同。稀释率从0.02 h-1增加到0.20 h-1，碳从0.34 g·L-1下降到0.03 g·L-1，下降了91%。而非油生物量中碳仅下降了46%。通过表1可计算非油生物量和油脂对底物的碳得率，结果如图2所示。通过分析非油生物量碳得率和油脂碳得率之间的关系可发现：随着消耗碳氮比减小，非油生物量对底物碳得率逐渐增大，在消耗碳氮比为61.6 mol·mol-1时，YX为0.14 mol·mol-1，当消耗碳氮比减少到13.2 mol·mol-1时增大到0.35 mol·mol-1。与之相反的是：YL从0.37 mol·mol-1下降到了0.17 mol·mol-1。氮源作为微生物生长的必需元素，一旦缺乏，微生物将停止生长。由此可见，在消耗碳氮比较高的情况下，更多碳源流向油脂合成；而在消耗碳氮比较低的情况下，则更多碳源流向非油生物量合成。这也进一步表明，为了进一步提高油脂对底物的碳得率和油脂生产强度，应该理性地设计培养基中碳氮比。

2.3 连续培养中油脂模型参数的确定

（1）YXmax和YLmax的确定

假设圆红冬孢酵母在氮源限制培养过程中，产物为菌体、油脂和二氧化碳，而没有其他副产物生成。根据式（3）和式（4）可知：因为YXmax和YLmax均为常数，所以YX和YL呈线性关系。依据YX和YL作图，并进行线性拟合，结果如图3所示。二者表现出良好的线性关系（R2=0.98）。因此

则有

因此，油脂对底物的最大碳得率为0.51 mol C·(mol C)-1，非油生物量对底物的最大碳得率为0.52 mol C·(mol C)-1。预测油脂对葡萄糖的最大油脂得率系数为0.27 g·g-1。非油生物量对底物的质量最大得率为0.43 g·g-1。（2）临界碳氮比(C/N)cri的确定

图3 圆红冬孢酵母　YX　max和　YL　max的确定Fig.3 Determination of YX　maxand YL　maxof R. toruloides AS 2.1389 in continuous cultivation

表2 模型参数值的评估以及和文献值的比较Table 2 Estimation of model parameters and their comparison with literature values

2.4 基于消耗碳氮比预测油脂得率模型验证

为了评价预测油脂得率的模型，以及对所得的参数进行验证，根据李永红[28]博士论文第五章分批油脂发酵数据进行了预测。在发酵过程中根据不同发酵时间所消耗碳源和氮源数量获得了消耗碳氮比，对发酵18 h之后的油脂得率进行了预测，并和实验值进行了比较，结果如表3所示。在消耗碳氮比为21.9 mol·mol-1时，预测值为0.14 g·g-1，而实验值为0.12 g·g-1，相差0.02 g·g-1。而在其他消耗碳氮比下，实验值和预测值吻合较好，在所有消耗碳氮比中预测值为实验值的95.2%～116.7%。

表3 油脂得率系数的实验值和预测值比较Table 3 Comparison of experimental and calculated values of Fa

3 结 论

符 号 说 明

CL- C——油脂中碳，mol

CXf- C ——非油生物量中碳，mol

C/N ——碳氮比，mol·mol-1

(C/N)cri——临界碳氮比，mol·mol-1

D ——稀释率，h-1

Fa ——油脂得率，g·g-1

ML——油脂摩尔质量，g·(mol C)-1

MS——底物摩尔质量，g·(mol C)-1

YL——油脂对底物碳得率，mol·mol-1

Yl——二氧化碳对底物碳得率，mol·mol-1

——细胞对底物最大碳得率，mol·mol-1

References

[1] RATLEDGE C, WYNN J P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms [J]. Adv. Appl. Microbiol., 2002, 51: 1-51.

[2] 赵宗保, 华艳艳, 刘波. 中国如何突破生物柴油产业的原料瓶颈[J].中国生物工程杂志, 2005, 25 (11): 6-11. ZHAO Z B, HUA Y Y, LIU B. How to secure triacylglycerol supply for Chinese biodiesel industry [J]. China Biotechnology, 2005, 25 (11): 6-11.

[3] EVANS C T, RATLEDGE C. Effect of nitrogen-source on lipid accumulation in oleaginous yeasts [J]. J. Gen. Microbiol., 1984, 130 (7): 1693-1704.

[4] EVANS C T, RATLEDGE C. Influence of nitrogen-metabolism on lipid accumulation by Rhodosporidium toruloides cbs 14 [J]. J. Gen. Microbiol., 1984, 130: 1705-1710.

[5] HASSAN M, BLANC P J, GRANGER L M, et al. Influence of nitrogen and iron limitations on lipid production by Cryptococcus curvatus grown in batch and fed-batch culture [J]. Process Biochem., 1996, 31 (4): 355-361.

[6] WU S G, HU C M, JIN G J, et al. Phosphate limitation mediated lipid production by Rhodosporidium toruloides [J]. Bioresour. Technol., 2010, 101 (15): 6124-6129.

[7] WU S, ZHAO X, SHEN H, et al. Microbial lipid production by Rhodosporidium toruloides under sulfate limited conditions [J]. Bioresour. Technol., 2011, 102 (2): 1803-1807.

[8] LI Y, ZHAO Z, BAI F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture [J]. Enzyme Microb. Technol., 2007, 41 (3): 312-317.

[9] GILL C O, HALL M J, RATLEDGE C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast (Candida 107) growing on glucose in single-stage continuous culture [J]. Appl. Environ. Microb., 1977, 33 (2): 231-239.

[10] HALL M J, RATLEDGE C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast (Candida-107) growing on glucose under various conditions in a one-stage and 2-stage continuous culture [J]. Appl. Environ. Microb., 1977, 33 (3): 577-584.

[11] YAMAUCHI H, MORI H, KOBAYASHI T, et al. Mass-production of lipids by Lipomyces starkeyi in microcomputer aided fed-batch culture [J]. J. Ferment. Tech., 1983, 61 (3): 275-280.

[12] ANGERBAUER C, SIEBENHOFER M, MITTELBACH M, et al. Conversion of sewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production [J]. Bioresour. Technol., 2008, 99 (8): 3051-3056.

[13] 沈宏伟, 靳国杰, 胡翠敏,等. 恒化培养稀释率和碳氮比对圆红冬孢酵母油脂积累的影响 [J]. 生物工程学报, 2012, 28 (1): 56-64. SHEN H W, JIN G J, HU C M, et al. Effects of dilution rate and carbon-to-nitrogen ratio on lipid accumulation by Rhodosporidium toruloides under chemostat conditions [J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2012, 28 (1): 56-64.

[14] GRANGER L M, PERLOT P, GOMA G, et al. Kinetics of growth and fatty-acid production of Rhodotorula glutinis [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 37 (1): 13-17.

[15] SATTUR A P, KARANTH N G. Production of microbial lipids (3): Influence of C/N ratio experimental observations [J]. Biotechnol.Bioeng., 1989, 34 (6): 872-874.

[16] YKEMA A, VERBREE E C, VANVERSEVELD H W, et al. Mathematical modelling of lipid production by oleaginous yeasts in continuous cultures [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1986, 52: 491-506.

[17] GRANGER L M, PERLOT P, GOMA G, et al. Efficiency of fatty acid synthesis by oleaginous yeasts: prediction of yield and fatty acid cell content from consumed C/N ratio by a simple method [J]. Biotechnol. Bioeng., 1993, 42 (10): 1151-1156.

[18] HU C M, ZHAO X, ZHAO J, et al. Effects of biomass hydrolysis by-products on oleaginous yeast Rhodosporidium Toruloides [J]. Bioresour. Technol., 2009, 100: 4843-4847.

[19] 华艳艳, 赵鑫, 赵金, 等. 圆红冬孢酵母发酵菊芋块茎产油脂的研究 [J]. 中国生物工程杂志, 2007, 27 (10): 59-63. HUA Y Y, ZHAO X, ZHAO J, et al. Lipid production by Rhodosporidium toruloides using Jerusalem artichoke tubers [J]. China Biotechnology, 2007, 27 (10): 59-63.

[20] BOMMAREDDY R R, SABRA W, MAHESHWARI G, et al. Metabolic network analysis and experimental study of lipid production in Rhodosporidium toruloides grown on single and mixed substrates [J]. Microbial Cell Factories, 2015, 14: 36.

[21] MATSAKAS L, BONTURIL N, MIRANDA E A, et al. High concentrations of dried sorghum stalks as a biomass feedstock for single cell oil production by Rhodosporidium toruloides [J]. Biotechnol. Biofuels, 2015, 8: 6.

[22] ZHU Z W, ZHANG S F, LIU H W, et al. A multi-omic map of the lipid-producing yeast Rhodosporidium toruloides [J]. Nature Communications, 2012, 3: 1112.

[23] GANUZA E, IZQUIERDO M S. Lipid accumulation in Schizochytrium G13/2S produced in continuous culture [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76 (5): 985-990.

[24] DEKKERS J, DE KOK H E, ROELS J. Energetics of Saccharomyces cerevisiae CBS 426: comparison of anaerobic and aerobic glucose limitation [J]. Biotechnol. Bioeng., 1981, 23 (5): 1023-1035.

[25] RATLEGE C, DAWSON P S S, RATTRAY J. Biotechnology for the Oils & Fats Industry [M]. USA: American Oil Chemists’ Society, 1984.

[26] KOIKE Y, CAI H J, HIGASHIYAMA K, et al. Effect of consumed carbon to nitrogen ratio on mycelial morphology and arachidonic acid production in cultures of Mortierella alpine [J]. J. Biosci. Bioeng., 2001, 91 (4): 382-389.

[27] MEEUWSE P, TRAMPER J, RINZEMA A. Modeling lipid accumulation in oleaginous fungi in chemostat cultures (Ⅰ): Development and validation of a chemostat model for Umbelopsis isabellina [J]. Bioprocess Biosyst. Eng., 2011, 34: 939-949.

[28] 李永红. 圆红冬孢酵母生产油脂的研究 [D]. 大连: 大连理工大学, 2007. LI Y H. Lipid production by Rhodosporidium toruloides [D]. Dalian: Dalian University of Technology, 2007.

Foundation item: supported by the National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of China (2014BAD02B02) and the State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology (2013001).

Prediction of lipid yield and substrate distribution based on consumed C/N ratio

SHEN Hongwei, YANG Xiaobing, GONG Zhiwei, JIN Guojie, ZHAO Zongbao
(Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning, China)

Abstract:Microbial lipids, similar to vegetable oil in their composition, are potential alternative feedstock for biodiesel production and oleochemical industries as well. However, the high costs of microbial lipids production are the major bottleneck. The synthesis of microbial lipids is considered as a partially growth-associated process with inconstant production rates. For the prediction of lipid yield and substrate distribution, a chemostat process was established for lipid production by the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides AS 2.1389 under nitrogen limitation conditions, and a correlation on carbon distribution between lipid and lipid-free cell components was also developed. The maximal lipid yieldand cell mass yieldwere predicted to be 0.51 mol C·(mol C)-1and 0.52 mol C·(mol C)-1, respectively. Together with the element balance analysis, the critical C/N ratio for switching to lipid production was estimated to be 12.1 mol·mol-1. The prediction for lipid yields was 95.2%—116.7% of those measured experimentally, indicating that the model was reliable.

Key words:fermentation; bioprocess; model; parameter estimation; C/N; microbial lipids

Corresponding author:Prof. ZHAO Zongbao, Zhaozb@dicp.ac.cn

基金项目：国家科技支撑项目（2014BAD02B02）；车用生物燃料技术国家重点实验室开放基金（2013001）。

中图分类号：TQ 028.8

文献标志码：A

文章编号：0438—1157（2016）01—0324—07

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20150454