黑果枸杞叶多糖LRLP3的结构、抗氧化活性及免疫活性

刘　洋，殷　璐，龚桂萍，彭艺芳，黄琳娟，王仲孚

(西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西安710069)



黑果枸杞叶多糖LRLP3的结构、抗氧化活性及免疫活性

刘洋，殷璐，龚桂萍，彭艺芳，黄琳娟，王仲孚

(西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西安710069)

摘要黑果枸杞叶经水提醇沉，离子交换柱层析和凝胶柱层析分离纯化，得到平均分子量为79400的均一多糖组分LRLP3.对该多糖的理化性质、结构、抗氧化活性及免疫活性的研究结果表明，LRLP3为多分支结构，主链为( 1→3)βGalp，大部分半乳糖6位存在分支;支链由( 1→6)βGalp，( 1→4)βGalp，( 1→3)βAraf，( 1→3)αArap，( 1→5)βAraf和( 1→2，4)αRhap组成，非还原末端由αAraf，βGalp和βGlcp组成.LRLP3具有较强的还原能力，可显著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基，有效抑制Cu2+/H2O2诱导的蛋白氧化损伤和H2O2诱导的细胞氧化损伤.LRLP3在体外对未经诱导和经刀豆蛋白( ConA)或脂多糖( LPS)诱导的小鼠脾细胞增殖均有促进作用.

关键词黑果枸杞叶;多糖;结构分析;抗氧化活性;免疫活性

黑果枸杞( Lyciumruthenicum Murray)系茄科( Solanaceae)枸杞属( Lycium)植物，主要分布于我国西北地区，是民族医药中的常用药材［1］.研究发现，黑果枸杞果实中含有氨基酸、维生素、矿物质和微量元素等丰富的营养成分以及多糖、色素和黄酮等活性成分［2～4］，其果实提取物具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗动脉硬化和免疫调节等功效［5～7］.近年来，已有对黑果枸杞叶活性成分进行研究的报道.白红进等［8］测定了黑果枸杞叶片甲醇提取物的抗氧化活性，发现其对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基均有较好的清除能力;李进等［9］发现黑果枸杞叶片总黄酮能显著抑制小鼠红细胞溶血，增强小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝组织脂质过氧化产物丙二醛( MDA)的生成.多糖是一类具有重要生物活性的物质［10～14］，且这些生物活性与其理化性质和结构有着密切关系［15～17］.

本文从黑果枸杞叶中分离纯化得到均一性多糖组分LRLP3，对其理化性质、化学结构、抗氧化活性和免疫活性进行了研究，从分子水平上为阐明多糖的构效关系奠定了理论基础.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

黑果枸杞叶子收集于新疆柴达木盆地; Hela细胞购自中国科学院上海细胞所; Balb/c雄性小鼠购自第四军医大学实验动物中心.DEAE-纤维素( DEAE-52)购自Whatman公司; Sephadex G-100填料购自Pharmacia公司;鸡蛋白蛋白( OVA)、牛血清白蛋白( BSA)、考马斯亮蓝、胰蛋白酶、噻唑蓝( MTT)、脂多糖( LPS)、刀豆蛋白( ConA)、甲基玛琳硼烷络合物、吩嗪硫酸甲酯( PMS)、氯化硝基四氮唑蓝( NBT)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)和二甲基亚砜( DMSO)均购自Sigma公司;其它试剂均为分析纯.

Waters 2695型高效液相色谱仪(配置2414示差折光检测器，美国Waters公司) ; Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS紫外分光光度计(美国铂金埃尔默公司) ; Shimadzu GC 2010型气相色谱仪，rtx-50型色谱柱(日本岛津公司) ; Shimadzu GCMS-QP 2010型气相色谱-质谱联用仪，rtx-5型色谱柱(日本岛津公司) ; Multiskan Ascent酶标仪(美国热电公司) ; Thermo-LTQ XL液相质谱联用仪(美国热电公司).

1.2实验过程

1.2.1 LRLP3的分离和纯化将黑果枸杞叶阴干，粉碎过筛后，用80℃热水提取、浓缩，经醇沉、Savage法［18］脱蛋白、透析(透析袋截留分子量为3000)、冻干得黑果枸杞叶粗多糖.粗多糖经DEAE-52离子交换柱和Sephadex G-100凝胶过滤色谱柱分离纯化后得到多糖组分LRLP3.

1.2.2 LRLP3的理化性质测定采用高效凝胶渗透色谱法［19］( HPGPC)对LRLP3的相对分子量进行测定.

采用苯酚-硫酸法［20］和Bradford法［21］对LRLP3的总糖和蛋白质含量进行测定.

采用Jacob Lehrfeld法［22］对LRLP3的单糖组成进行分析.GC程序升温过程: 180℃保持2 min，以6℃/min的速度升温至210℃，再以0. 3℃/min的速度提升到215℃，最后以6℃/min的速度升温至240℃保持30 min.载气为氮气/空气，柱流速0. 88 mL/min，压力110 kPa，进样量0. 5 μL;分流比19∶1.

采用KBr压片法［23］，于4000～400 cm－1范围内进行红外光谱测定;用紫外分光光度计于200～400 nm波长范围内对LRLP3进行紫外光谱扫描.

1.2.3 LRLP3的结构表征部分酸水解:称取40 mg干燥LRLP3样品，加入10 mL 0. 02 mol/L的H2SO4，于80℃搅拌反应12 h.对水透析3 d后，取透析袋内溶液冻干得到主链LRLP3-I;将袋外溶液减压浓缩后用碳酸钡溶液中和，离心取上层清液，冻干后得到支链LRLP3-O.按照LRLP3的单糖组成分析方法对LRLP3-I和LRLP3-O分别进行单糖组成分析.

甲基化分析:采用Need法［24］对样品LRLP3和LRLP3-I进行甲基化.甲基化过程重复3次，由红外光谱检测发现样品甲基化完全.将全甲基化样品加入2 mL甲酸中，于100℃水解3 h去聚合，减压抽干后加入甲醇抽干，重复3次以去除残留甲酸.然后，加入三氟乙酸( TFA，2 mol/L)于121℃水解2 h，加蒸馏水抽干数次，用硼氢化钠还原1. 5 h，抽干后进行乙酰化，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物，对其进行GC和GC-MS分析.程序升温条件:于140℃保持3 min，然后以2℃/min的速度升温至250℃并保持20 min.

LRLP3-O的ESI-MS分析:取少量LRLP3-O过阳离子交换树脂除去盐，用氮气吹干后溶于适量甲醇溶液中，于正离子模式下进行ESI-MS检测［25］.

LRLP3的核磁共振分析:取30 mg干燥LRLP3样品溶于1 mL高纯度重水中，冻干后再溶于重水中，反复交换3次，将样品用重水溶于5 mm核磁管中，于30℃在600 MHz核磁共振仪( Varian)上采集1H NMR和13C NMR谱.

1.2.4 LRLP3的抗氧化活性采用Oyaizu等［26］的方法测定LRLP3的还原能力.

采用Shimada等［27］的方法测定LRLP3清除DPPH自由基的能力.

采用Fenton系统［28］测定LRLP3清除羟自由基的能力.

采用PMS-NADH-NBT系统［29］测定LRLP3清除超氧阴离子的能力.

其中，As为样品的吸光值，Ac为空白对照吸光值.

采用Cu2+/H2O2诱导的BSA蛋白氧化损伤实验［30］测定LRLP3在蛋白水平上的抗氧化活性.蛋白含量由Quanlity One 4.6.4软件分析，根据蛋白的含量判断样品抗氧化能力的强弱，即蛋白的含量越高，LRLP3的抗氧化活性越高，反之亦然.

采用H2O2氧化损伤细胞模型［31］对LRLP3的体外细胞抗氧化活性进行测定.Cell relative survival rate( %) = As/Ac×100%，根据细胞相对存活率的高低判断样品抗氧化能力的强弱，即细胞的相对存活率越高，LRLP3的抗氧化能力越强，反之亦然.

1.2.5 LRLP3的免疫活性小鼠脾细胞的制备:无菌环境下取10周雄性Balb/c小鼠脾脏，用磷酸盐缓冲液( PBS)清洗3次，加入适量PBS缓冲液于100目细胞筛上研磨，于1000 r/min转速下离心6min;弃去上层清液，加入红细胞裂解液，混合均匀，静置5 min后加入PBS缓冲液，于1000 r/min转速下离心5 min;弃去上层清液，用PBS缓冲液清洗数次直至无红色物质，用含胎牛血清( FBS，体积分数10%)的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至5×106Cell/mL.

采用Cho等［32］的方法测定LRLP3单独刺激组以及LRLP3与有丝分裂原ConA( 5 μg/mL)或LPS ( 10 μg/mL)共同刺激组对小鼠脾细胞增殖的影响.Growth index of mouse spleen=As/Ac.

1.3统计学分析

实验数据用Microsoft Excel 2007软件处理，结果用平均值±标准差表示;用SPSS 12.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析( ANOVO)及Tukey多重比较进行差异显著性分析，P＜0. 05说明组间差异具有显著性意义.

2　结果与讨论

2.1 LRLP3的分离纯化和理化性质

各新升格本科院校可根据本校艺体类本科专业的办学规模，将艺体类的专业英语按专业大类分为美术类、音乐类、体育类，或按照艺体类各细化专业进行划分，共设置拓展层和提高层两个层级：拓展层专业英语开设2学期，提高层专业英语开设1学期，每学期都为2个学分。由于英语基础与能力水平相对偏低的学生的语言基础需继续夯实、语言的基本技能需继续提高，因此该层级的专业英语不单独开设，而是在通用英语教学中适当融入相关专业知识的内容。同样，同一层级如有多个教学班，实行走班制。

将500 g黑果枸杞叶片粉末用80℃热水提取2次，合并提取液减压浓缩，经乙醇沉淀、Savage试剂除游离蛋白、对水透析及冷冻干燥后得2. 7 g粗多糖.粗多糖经DEAE-52纤维素柱层析，分别以蒸馏水和0. 05，0. 10，0. 25，0. 50 mol/L NaHCO3溶液进行梯度洗脱，分离得到5个多糖组分.其中得率较多的第3个组分(用0. 10 mol/L NaHCO3洗脱)经Sephdex G100凝胶过滤柱分离，用0. 1 mol/L NaCl溶液洗脱，进一步纯化得到200 mg多糖组分LRLP3.

高效凝胶渗透色谱测定结果表明，LRLP3在HPLC谱图上显示单一对称峰(见本文支持信息图S1)，说明其为均一性多糖，可进行下一步结构和活性测定.根据保留时间计算其相对分子量为79400.硫酸苯酚法测得其总糖含量为98. 2%，Bradford法测得其蛋白质含量为1. 3%.紫外光谱扫描结果表明，LRLP3在波长200 nm处有很强的吸收峰，而在波长280 nm处几乎无吸收，说明该多糖几乎不含蛋白质，这与糖含量及蛋白含量测定结果一致.

红外光谱分析结果表明，LRLP3具有多糖典型的特征吸收峰，3419 cm－1处为多糖游离氢键上O—H的伸缩振动，2950 cm－1处为C—H键的伸缩振动峰.单糖组成分析结果显示，LRLP3主要由阿拉伯糖( Ara)和半乳糖( Gal)组成，另外含有少量的鼠李糖( Rha)和葡萄糖( Glc)，其相对摩尔比为2∶1∶0. 12∶0. 06.

2.2 LRLP3的结构解析

2.2.1 LRLP3的甲基化分析为了解析LRLP3的化学结构，判定各单糖残基之间的连接方式，先将LRLP3完全甲基化，之后再经完全酸水解、还原和乙酰化处理后进行GC和GC-MS分析.LRLP3在GC总离子流图中共出现11个峰，分别代表了11种糖残基，根据其在GC上的出峰时间和对应的质谱离子碎片峰，与标准谱图进行对照，确定了糖残基的类型.再根据部分甲基化糖醇乙酸酯在GC上的峰面积与相应的响应因子［33］，计算得到各甲基化糖基的相对摩尔比，结果如表1所示.

Table 1　Partially O-methylated alditol acetates of LRLP3 and LRLP3-I

由表1可知，LRLP3具有多分支的结构特征，分支糖由大量的半乳糖以-3，6) Galp( 1-连接方式以及少量的鼠李糖以-2，4) Rhap( 1-连接方式组成.阿拉伯糖以Araf( 1-，-3) Araf( 1-，-3) Arap( 1-和-5) Araf( 1-这4种连接方式存在，所占比例为所有糖基的62. 9%;半乳糖以Galp( 1-，-4) Galp( 1-，-3) Galp( 1，-6) Galp( 1-和-3，6) Galp( 1-这5种连接方式存在，所占比例为31. 5%;鼠李糖以-2，4) Rhap( 1-分支方式存在，所占比例为3. 7%;葡萄糖则以末端糖Glcp( 1-形式存在，所占比例为1. 9%.在甲基化分析中，各种糖基所占比例和单糖组成分析相符，说明在甲基化过程中糖链未受到破损.

2.2.2 LRLP3的部分酸水解和LRLP3-I的甲基化分析由于LRLP3的甲基化分析结果无法确定该多糖的主链和支链糖基，因此进一步采用H2SO4( 0. 02 mol/L)对其进行部分酸水解.样品经过部分酸水解后对蒸馏水透析，得到透析袋内大分子( LRLP3-I)和透析袋外小分子( LRLP3-O)两部分.分别进行单糖组成分析，结果表明，LRLP3-I仅由半乳糖组成，说明该多糖的主链由半乳糖构成;而LRLP3-O则由阿拉伯糖和少量的鼠李糖和葡萄糖组成，相对摩尔比为1∶0. 06∶0. 03，说明该多糖的支链主要由阿拉伯糖构成.

对比LRLP3与LRLP3-I的甲基化结果(表1)发现，部分酸水解后，阿拉伯糖基、鼠李糖残基和葡萄糖残基完全消失，说明其都位于多糖的支链，这与单糖组成分析结果一致.各半乳糖残基的数量也发生了变化，-4) Galp( 1-消失，-3，6) Galp( 1-减少，-6) Galp( 1-和Galp( 1-增加.一方面，-4) Galp( 1-减少数与Galp( 1-增加数相等，说明-4) Galp( 1-靠近主链，并且与靠近末端的阿拉伯糖残基相连，当阿拉伯糖被酸水解掉以后，-4) Galp( 1-成为新的末端Galp( 1-;另一方面，-3，6) Galp( 1-减少的数量与-6) Galp( 1-增加的数量相等，推测其原因为在酸的作用下，-3，6) Galp( 1-在O3位发生水解，致使-3，6) Galp( 1-变成-6) Galp( 1-.

2.2.3 LRLP3-O的ESI-MS分析为了进一步研究该多糖的支链结构，对LRLP3-O进行ESI-MS一级质谱分析，结果如图1所示(二级质谱见本文支持信息图S2).可见，LRLP3的支链含有大量不同聚合度的阿拉伯糖，以及1个鼠李糖和不同聚合度的阿拉伯糖.

2.2.4 LRLP3的NMR谱图分析采用NMR对LRLP3的糖苷键构型进行分析.根据文献［34～36］的报道和上述分析结果，对NMR谱图中的化学位移进行了归属.

Fig.1　ESI-MS analysis of LRLP3-O

在LRLP3的1H NMR氢谱［见本文支持信息图S3( A)］中，有3种异头碳的氢位移，δ为5. 26， 5. 10和4. 53，分别由T-α-Araf，β-Araf和β-Glcp产生;δ 1. 26由α-Rhap的H6产生.在LRLP3的13C NMR谱［见本文支持信息图S3( B)］中，δ为110. 2，106. 83，105. 4，104. 4，103. 6和96. 8分别归属为T-α-Araf，β-Glcp，1，3-α-Arap，1，3-β-Araf，1，5-β-Araf和T-β-Glcp;δ 19. 2为α-Rhap C6的特征化学位移.

综合单糖组成、部分酸水解、甲基化、质谱分析和核磁共振分析的结果，推测LRLP3是一种具有多分支结构的阿拉伯半乳聚糖，可能具有如图2所示的重复单元结构.

将黑果枸杞叶多糖( LRLP3)与黑果枸杞果实多糖［37］( LRGP3)的理化性质和结构进行比较发现，两者存在异同.在理化性质方面，LRLP3和LRGP3的相对分子量、糖含量和蛋白含量均相差不大，但二者的单糖组成存在较大差异，LRLP3中含有Glc，而LRGP3没有，而且各种糖的相对摩尔比也不同.在结构方面，两者都是主链结构为1→3-linked β-Galp的半乳阿拉伯聚糖，但其支链组成和聚合度存在较大差异: LRLP3含有1，3-linked α-Araf和1，3-linked α-Arap，而LRGP3含有1，2-linked α-Araf，且末端组成也不同( LRLP3含有β-Glcp末端，而LRGP3没有).

Fig.2　Hypothetical structure of the repeat unit of LRLP3

2.3 LRLP3的体外抗氧化活性

2.3.1 LRLP3的还原能力及清除自由基能力通常，样品的还原能力与抗氧化活性之间存在显著的正相关性，还原能力的高低可以反映抗氧化能力的强弱.为了研究LRLP3的抗氧化性，首先测定了其还原能力，结果如图3( A)所示，不同浓度的LRLP3都具有一定的还原能力.在0. 5～1. 0 mg/mL浓度范围内，LRLP3的还原能力无明显变化;当浓度＞1. 0 mg/mL时，吸光值随着浓度的增加而升高，即还原能力随着浓度的增大而显著增加，说明LRLP3具有抗氧化潜力.

Fig.3　Antioxidant effect in vitro of LRLP3( A) Reducing power of LRLP3; ( B) scavenging effect on DPPH radical by LRLP3; ( C) scavenging effect on hydroxyl radical by LRLP3; ( D) scavenging effect on superoxide radical by LRLP3.The results were from three independent experiments and expressed as means±S.D.

DPPH自由基清除实验结果如图3( B)所示，不同浓度的LRLP3对DPPH自由基均有显著的清除作用.在实验浓度范围内，LRLP3对DPPH自由基的清除率随着浓度的增大而提高，清除率依次为38. 2%，58. 9%，62. 2%，70. 3%和75. 6%，其IC50值为0. 95 mg/mL.与维生素C( Vc，IC50=0. 041 mg/ mL)相比，其对DPPH的清除能力虽然有一定差距，但也有显著的清除作用.

采用Fenton系统考察了LRLP3对羟自由基的清除能力，结果如图3( C)所示.不同浓度的LRLP3对羟自由基表现出一定的清除作用，并且清除能力随着浓度的增大而提高.当浓度为3 mg/mL时，清除率达到了80%，其IC50=0. 671 mg/mL，高于Vc( IC50=1. 54 mg/mL)的清除羟自由基能力.

采用PMS-NADH-NBT系统测定了LRLP3对超氧阴离子的清除能力，结果如图3( D)所示.不同浓度的LRLP3均对超氧阴离子具有良好的清除能力.在0. 05～0. 1 mg/mL范围内，其清除能力无明显变化;当浓度为0. 5，1和2 mg/mL时，其清除率分别为45. 87%，62. 36%和92. 13%.当Vc浓度为2 mg/mL时，对超氧阴离子的清除率为68. 19%，因此，LRLP3对超氧阴离子的清除能力大于Vc.

2.3.2 LRLP3在蛋白和细胞水平上的抗氧化活性在生物体内，Cu2+和H2O2同时存在会产生羟自由基，当羟自由基水平过高时会对大分子物质如蛋白质造成损伤.因此，用Cu2+/H2O2体系考察了LRLP3在蛋白水平上的抗氧化作用，结果如图4( A)所示.可见，不同浓度的LRLP3对Cu2+/H2O2诱导的BSA蛋白氧化损伤均具有显著的保护作用.当LRLP3浓度达到3 mg/mL时，与对照组(未加LRLP3)相比，蛋白损伤率由82. 7%下降至30. 8%，说明LRLP3是一种很好的抗氧化剂.

Fig.4　Protective effect of LRLP3 on Cu2+/H2O2-induced BSA protein damage( A) and H2O2-induced HeLa cells damage( B)The results were obtained from three independent experiments and expressed as means±S.D.＊＊P＜0. 01 compared with control group;＊＊＊P＜0. 001 compared with control group;“-”means“BSA protein or HeLa cells were not treated with H2O2or Cu2+/H2O2or LRLP3”; “+”means“BSA protein or HeLa cells were treated with H2O2or Cu2+/H2O2or LRLP3”.

图4( B)结果表明，LRLP3对H2O2诱导的氧化损伤细胞模型具有一定的保护作用，受H2O2损伤的细胞的存活率明显低于未损伤细胞.当LRLP3浓度＜12. 5 μg/mL时，对氧化损伤细胞无保护作用;但当其浓度达到25 μg/mL时，对氧化损伤细胞具有保护作用，细胞相对存活率提高了7%;当浓度为200 μg/mL时，细胞相对存活率达到101. 4%，与未损伤细胞存活率无差异.

2.4 LRLP3的免疫活性

脾脏是T淋巴细胞和B淋巴细胞定居及接受抗原刺激后产生免疫应答的重要场所，分化激活后的淋巴细胞能够产生多重细胞因子，与机体的细胞免疫和体液免疫密切相关［38］.本文采用MTT法检测LRLP3在体外对正常小鼠脾细胞增殖能力的影响以判断LRLP3是否具有免疫活性，结果见图5.

对于LRLP3单独刺激组［图5( A)］，当样品浓度＜25 μg/mL时，与RPMI-1640对照组(脾细胞增殖指数设为1)相比，增殖指数为1. 002，表明在该浓度下LRLP3对小鼠脾细胞增殖无影响;而浓度为50 μg/mL时，脾细胞增殖指数增加;当浓度达到800 μg/mL时，增殖指数为1. 45.这表明当LRLP3浓度在50～800 μg/mL范围内，能够刺激小鼠脾细胞的增殖.

Fig.5　In vitro effects of LRLP3 on splenocyte proliferation index( A)，ConA-induced splenocyte proliferation( B) and LPS-induced splenocyte proliferation( C)The results were from three independent experiments and expressed as means±S.D.＊＊P＜0. 01 compared with control group;“－”means “splenocytes were not treated with LPS or ConA or LRLP3”;“+”means“splenocytes were treated with LPS or ConA or LRLP3”.

对于ConA诱导的T淋巴细胞刺激组［图5( B)］，在ConA和不同浓度( 0～800 μg/mL) LRLP3共同作用下，脾细胞增殖指数随着LRLP3浓度的增加而增长，表明在T细胞有丝分裂原ConA存在下，LR-LP3对小鼠脾细胞增殖具有促进作用.

对于LPS诱导的B淋巴细胞刺激组［图5( C)］，脾细胞增殖指数全部增长，并呈现浓度依赖性.当LRLP3浓度达到800 μg/mL时，增殖指数为对照组的2. 48倍，表明在B细胞有丝分裂原LPS存在下，LRLP3对小鼠脾细胞增殖同样具有促进作用.

此外，对于同一浓度的3种不同刺激下的腺细胞增殖能力而言，LPS诱导的B淋巴细胞刺激组的增殖能力＞ConA诱导的T淋巴细胞刺激组＞多糖单独刺激组.脾细胞增殖实验结果表明，LRLP3是一种潜在的免疫活性成分，对小鼠的细胞免疫功能具有促进作用.

3　结　论

从黑果枸杞叶中分离纯化出水溶性多糖LRLP3，研究了其理化性质、化学结构、体外抗氧化活性和免疫活性.结果表明，LRLP3与LRGP3(黑果枸杞果实多糖)同样是一种具有免疫增强活性的阿拉伯半乳聚糖;同时，LRLP3具有良好的还原能力，具有清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( DPPH)自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的能力，还可以有效抑制Cu2+/H2O2诱导的蛋白氧化损伤和H2O2诱导的细胞氧化损伤.因此，LRLP3可以作为天然抗氧化剂和免疫增强剂应用于食品和医药领域.

支持信息见http: / /www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150690.

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Structural Characterization，Antioxidant Activity and Immunomodulatory Activity of the Polysaccharide LRLP3 from Leaves of Lycium ruthenicum Murra†

LIU Yang，YIN Lu，GONG Guiping，PENG Yifang，HUANG Linjuan，WANG Zhongfu*
( Key laboratory for Western China Resource Biology and Biotechnology，Ministry of Education，College of Life Science，Northwest University，Xi’an 710069，China)

†Supported by the National Natural Science Foundation of China( Nos.21375103，31370804) and the Scientific Research Program Fund for Shaanxi Province Key Laboratory，China( No.14JS01).

Abstract A combination of chemical and instrumental analysis was performed to investigate the structural characterization and biological activity of a polysaccharide LRLP3 which was isolated from the Lycium ruthenicum leaves.The results demonstrated that LRLP3 was a highly branched polysaccharide with a backbone of ( 1→3) -linked-βGalp substituted at C-6 position by galactosyl.The branches were composed of( 1→6) -linkedβGalp，( 1→4) -linked-βGalp，( 1→3) -linked-αAraf and βArap，( 1→5) -linked-αAraf，and ( 1→2，4) -linked αRhap，and the terminal residues were αAraf，βGalp and βGlcp.Additional，LRLP3 had strong reducing power，could significantly scavenge DPPH，hydroxyl and superoxide free radical，could effectually inhibit Cu2+/H2O2induced protein damage and H2O2induced cell damage in vitro.Meanwhile，immunological assay showed that LRLP3 could stimulate proliferation of spleen lymphocytes significantly with or without mitogens ( ConA or LPS) in vitro.Therefore，LRLP3 was a natural arabinogalactan which had the potential function of antioxidant and immunoloregulation.

KeywordsLyciumruthenicum Murray leaves; Polysaccharide; Structural analysis; Antioxidant activity; Immunological activity

( Ed.: P，H，F，K)

基金项目:国家自然科学基金(批准号: 21375103，31370804)和陕西省重点实验室科研项目(批准号: 14JS101)资助.

收稿日期:2015-09-08.网络出版日期: 2016-01-04.

doi:10.7503/cjcu20150690

中图分类号O629.12

文献标志码A

联系人简介:王仲孚，男，博士，教授，博士生导师，主要从事糖生物学与糖工程方面的研究.E-mail: wangzhf@ nwu.edu.cn