单环刺螠呼吸肠JNK通路对硫化物的应激反应❋

刘树人， 刘晓龙， 李　岳， 马晓玉， 张志峰

(中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室,山东 青岛 266003)



单环刺螠呼吸肠JNK通路对硫化物的应激反应❋

刘树人， 刘晓龙， 李岳， 马晓玉， 张志峰❋❋

(中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室,山东 青岛 266003)

摘要：JNK通路是MAPK信号通路的子通路之一，参与生物体的多种应激反应。本研究分析了单环刺螠JNK分子的特征，并对50和150 μmol/L硫化物应激下单环刺螠呼吸肠中JNK的反应进行了研究。单环刺螠JNK cDNA全长2 102 bp，编码403个氨基酸，推导的氨基酸序列具有JNK家族的典型特征。Western blot(蛋白免疫印迹)检测显示，单环刺螠呼吸肠中JNK总蛋白数量在硫化物暴露期间未见明显的变化；当单环刺螠暴露于硫化物环境中时，其呼吸肠细胞中磷酸化JNK的含量呈现显著性地持续升高趋势，其起始显著升高发生在单环刺螠暴露0.5 h，随着暴露时间的延长，磷酸化JNK的含量持续升高，并在150 μmol/L硫化物暴露48 h时其含量增至最高，为对照组的10.2倍；此外，暴露于50 μmol/L硫化物中的单环刺螠呼吸肠磷酸化JNK含量普遍低于150 μmol/L硫化物相同暴露时间的磷酸化JNK的含量。研究结果表明，单环刺螠JNK基因拥有进化保守性，且JNK信号通路在单环刺螠呼吸肠应对硫化物中发挥作用。

关键词：单环刺螠；硫化物；JNK通路

Liu Shu-Ren, Liu Xiao-Long, Li Yue, et al. Response of JNK pathway in the hindgut ofUrechisunicinctusafter sulfide stress[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(2)： 76-82.

哺乳动物细胞中已经发现了4条并行的MAPKs(丝裂原激活蛋白激酶，Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路，分别是ERK5(BMK1)通路，ERK(Extracellular signal-regulated kinase)通路，p38MAPK(p38 Mitogen-activated protein kinase)通路，JNK/SAPK(c-Jun N-terminal kinase/stress-activated kinase)通路[1]。MAPKs通路可被多种刺激(丝裂原、渗透压应激、热应激和促炎症因子等)所激活，调节细胞的增殖、分化、代谢、存活和凋亡等[1-2]。而不同的细胞外刺激激活不同的MAPKs信号通路，并通过其相互调控进而介导不同的细胞生物学效应[2]。JNK信号通路在细胞分化、分裂、癌变、凋亡及免疫反应中起着重要的调控作用。已有研究表明，JNK信号通路对紫外线、渗透压变化、高温、DNA损伤剂、炎症细胞因子、蛋白抑制剂等外界刺激有强烈的反应[3-5]；此外，它还可被一些化学物质诸如顺铂、硫芥气、金属离子、二氧化硫、硫化氢等所激活[6-8]。Osipov等报道，在猪的缺血再灌注模型中，H2S可以上调ERK1/2的磷酸化激活水平[9]；在人的脐静脉内皮细胞中，H2S可激活p38MAPK[10]；但在大鼠动脉血管平滑肌细胞中，H2S抑制了受内皮素激活的p38MAPK的活性[11]；在人的PC12细胞中，H2S则通过下调ERK1/2和p38的磷酸化激活水平来应对化学性低氧对细胞的损伤[12]。有关H2S影响MAPK信号通路的研究结果似乎在不同细胞或物种之间存在差异，尚未达成一致的认识。

单环刺螠(Urechisunicinctus)俗称海肠子，类属螠虫动物门(Echiurioidea)、螠纲(Echiurida)、无管螠目(Xenopeneusta)、刺螠科(Urchidae)，主要分布于我国黄渤海沿岸、日本北海道和本州岛、朝鲜半岛和俄罗斯，是一种生活在沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区U型洞穴内的底栖生物种。已有研究表明,单环刺螠可以耐受、代谢和利用硫化物[13-16]。霍继革等[17]报道，硫化物可上调单环刺螠MAPKKK(1个MAPK信号通路的上游调控分子)mRNA的表达，表明MAPK信号通路可能参与单环刺螠应对硫化物的生理反应。本研究使用RACE技术克隆了单环刺螠JNK的全长cDNA序列；体外原核表达了JNK蛋白并制备其多克隆抗体；使用JNK多克隆抗体和磷酸化JNK单抗以及蛋白质印迹杂交(Western blot)技术，检测了50 μmol/L硫化物处理的单环刺螠呼吸肠(又称后肠)中JNK在总蛋白水平和激活(磷酸化JNK，p-JNK)水平上的变化。以期揭示JNK信号通路在单环刺螠应对硫化物中的作用，并为深入探讨MAPK信号通路的作用提供基础数据。

1材料与方法

1.1 主要试剂及试剂盒

Trizol试剂盒购自Invitrogen公司，SMARTTMRACE cDNA扩增试剂盒购自Clontech公司，Ni2+-NTA His-Bind Resins购自Novagen公司，RNAase-free DNAase I、PMD18-T载体、Xho I内切酶、BamH I内切酶、AD酶均购自Takara公司，ECL化学发光显色试剂盒购自碧云天生物，p-JNK抗体购自Santa Cruz公司，羊抗兔IgG购自上海生工生物。

1.2 实验动物处理和取样

单环刺螠购自青岛市四方路海产品市场，实验室内通气暂养一周。暂养期间，每日换水1/2(盐度28，pH=8.0,温度(20±1)℃)，投喂适量的单细胞藻(小新月菱形藻Nitzschiaclosteriumf.minutissima与小球藻Chlorellavulgaris)，实验前24 h停止通气和喂食。选择体表无伤痕的健康个体(体重(34.6±10.4) g)108尾，随机均分到9个含有30 L沙滤海水的养殖玻璃缸中；实验设置2个硫化物处理组(50、150 μmol/L硫化物组)和1个对照组(未加硫化物的自然海水)；每个组设3个重复的玻璃缸。各实验组中不同浓度的硫化物通过向水体中添加硫化物母液(10 mmol/L Na2S，pH=8.0)来实现；根据前期实验，每2 h检测和添加硫化物母液1次，使用亚甲基蓝法[18]检测水体中的硫化物浓度。实验期间，分别于0、0.25、0.5、1、1.5、2、6、24、48、72 h从各培养缸中取单环刺螠1条，解剖取呼吸肠，磷酸缓冲液中漂洗3次，液氮中速冻后，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 方法

1.3.1 单环刺螠JNKcDNA全长的获取以及序列分析

1.3.1.1总RNA的提取使用Trizol(Invitrogen)试剂盒并按照说明书提取单环刺螠呼吸肠总RNA。使用RNAase-free DNAase I(Takara)消除总RNA中的基因组DNA，1.2%琼脂糖电泳和紫外分光光度计法检测RNA的质量和浓度。

1.3.1.2 RACE扩增和全长cDNA的获得以单环刺螠呼吸肠总RNA为模板，使用SMARTTMRACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)并按照操作指南分别合成3’RACE和5’RACE的第一链cDNA模板。根据illumina RNA-seq转录组数据库(NCBI Sequence Read Archive http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi accession number: SRA122323)中获得的一段1 190 bp长的JNKcDNA序列，分别设计3’RACE和5’RACE特异性引物，GSP1：5’-AAGATCATCGAGCAGCTGGGGACAC-3’，GSP2：5’-TGGGAAGAGCT TCTCCGTCGGGTAT-3’。使用已获得的3’RACE和5’RACE cDNA第一链为模板进行RACE扩增。扩增产物分别经1.2%琼脂糖电泳，切胶回收特异性片段。按试剂盒说明书步骤将回收产物连入PMD18-T载体，使用热激法转化DH5α感受态细胞，而后进行氨苄抗性筛选，挑取菌落用M13+和M13-引物进行PCR筛选。将PCR筛选的阳性克隆送至华大基因进行测序。使用DNAMAN 6.0软件对所获得3’RACE和5’RACE序列进行全长cDNA拼接。

1.3.1.3 序列的分析及比较将获得的cDNA全长序列通过BLAST X和BLAST P程序在NCBI数据库中进行序列相似性及氨基酸保守性分析；利用ProtParam软件分析该蛋白的分子量及稳定性特征；用Clustal X软件进行氨基酸序列的多序列比对及功能结构域的查找；使用MEGA 5.05软件和邻接法(Neighbor-joining, NJ)构建系统进化树。

1.3.2 单环刺螠JNK蛋白多克隆抗体的制备及磷酸化JNK抗体的选择

1.3.2.1 单环刺螠JNK蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备根据已经获得的JNK全长cDNA序列设计1对引物，P1：5’-GGATCCATGAGTGGGAAATTACCAAG-3’(下划线序列为BamHI酶切位点)，P2：5’-CTCGAGTACACAACCTCCATATTCCT-3’(下划线序列为XhoI酶切位点),用于扩增JNK的ORF序列。PCR产物经1.2%琼脂糖电泳鉴定、回收和纯化，连接到PMD18-T载体，并且转入DH5α感受态细胞中送华大基因测序。

将含有JNKORF序列的PMD18-T载体和原核表达载体用BamHI和XhoI进行双酶切，回收片段用T4 DNA连接酶4 ℃连接过夜，将连接产物转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37 ℃培养过夜。挑菌落培养，提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切鉴定阳性克隆。

阳性克隆在含卡那霉素(100 μg/mL)的LB培养基中37 ℃震荡过夜，次日以1%的比例接种到LB培养基中进行扩大培养，37 ℃继续震荡培养4 h，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1 mmol/L,诱导表达3 h后的200 mL菌液以5 000 r/s离心10 min收集菌体。用20 mL PBS重悬菌体，冰浴中超声破碎至溶液澄清。在4 ℃、12 000 r/s离心10 min，收集包涵体沉淀。将包涵体溶于5 mL变性液(8 mol/L尿素，10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0), 0.1 mol/L磷酸钠，1 mmol/L β-巯基乙醇)中，4 ℃溶解5 h。4 ℃下12 000 r/s离心20 min收集上清。按照公司提供的操作说明，用Ni2+-NTA His-Bind Resins纯化JNK蛋白，收集洗脱液。SDS-PAGE分析鉴定洗脱液蛋白组分。使用Bradford检测蛋白含量之后，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

将纯化后的JNK重组蛋白约5 mg，送至上海生工生物进行多克隆抗体的合成。使用酶联免疫法进行多克隆抗体的效价检测。

1.3.2.2 JNK磷酸化抗体的选择根据氨基酸序列比对发现，单环刺螠JNK氨基酸序列与人JNK序列同源性高，尤其是在被抗体公司选作抗原的活化环部分，序列的同源性高达92%。因此根据Santa Cruz公司的建议，选择人p-JNK(G7) (Santa Cruz, CA, USA)用于检测本研究中激活态的单环刺螠p-JNK含量。

1.3.3 Western blot检测

1.3.3.1 总蛋白的提取取约100 mg单环刺螠呼吸肠组织于1 ml裂解液(150 mmol/L氯化钠,1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠, 0.1% SDS, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF和50 mmol/L Tris, pH=7.4)中冰上匀浆，然后12 000 r/s离心5 min，取上清蛋白溶液并用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，而后分装保存于-80 ℃冰箱。

1.3.3.2 Western blot取50 μg呼吸肠总蛋白加入20 μL含SDS和β-巯基乙醇的上样缓冲液中，99 ℃恒温变性10 min，SDS-PAGE(分离胶配制浓度为10%，浓缩胶配制浓度为5%)电泳。每1个样本每次跑胶2块，分别用于检测JNK总蛋白(t-JNK)和磷酸化JNK蛋白(p-JNK)。使用Trans-Blot®半干转印系统(Bio-Rad)将电泳分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(150 mA的电流在4 ℃转膜25 min)。取出PVDF膜，放入盛有5% BSA溶液(0.25 g BSA加5 mL TBST)中，摇床上封闭PVDF膜1 h，TBST漂洗5次，每次5 min。然后，将滤膜放入5% BSA溶液稀释的第一抗体(其中p-JNK (G7) (Santa Cruz, CA, USA)稀释2 000倍，JNK多克隆抗体稀释1 000倍)中，摇床上孵育2 h，TBST漂洗5次，每次5 min。用稀释的辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白(p-JNK膜使用1∶2 500的马抗鼠IgG(Cell Signaling Technology)，t-JNK膜使用1∶5 000稀释的羊抗兔IgG(上海生工)与PVDF膜温育)在摇床上孵育1 h。TBST漂洗5次，每次5 min。用ECL化学发光显色法和化学发光成像分析系统(Tanon 4 200 Multi，上海天能科技)进行显色并拍照。使用ImagequaNT v4.2软件(Molecular Dynamics)进行光密度分析，将0 h的目的条带光密度值设为1，其它时间的目的条带光密度值均与0 h条带相比，以倍数表示它们的大小并使用EXCEL2007软件制作柱形图。t-JNK和p-JNK的Western blot检测均重复3次，光密度值取3次的平均值。

1.3.4 数据处理所有数据均以平均数±标准误差表示。使用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey HSD检验，以P<0.05设为组间均值的显著性差异水平。

2结果

2.1 单环刺螠JNK的序列特征

通过3’和5’RACE扩增分别获得2 845和910 bp的核苷酸序列，组装后的全长cDNA序列为2 102 bp(GenBank序列号：KP893339)。该全长cDNA序列包含5’非编码翻译区(5’UTR)160 bp，3’UTR 730 bp和编码403个氨基酸的开放阅读框1 212 bp，该蛋白的理论等电点为7.15，分子量为45.9 kDa。序列分析发现，该推导的氨基酸序列包含4个高度保守的真核生物JNK特征结构域，分别是富甘氨酸环(Glycine-rich loop, P-loop)、催化环(Catalytic loop)、通用锚定结构域(Common docking, CD)和含有双磷酸化位点(TPY)的激活环(Activation loop)(见图1)。同源性分析显示该序列与已报道的其他物种JNK具有高的同源性，与人、小鼠、原鸡、非洲爪蟾、斑马鱼、内华达古白蚁、毕氏粗角蚁、加利福尼亚海蜗牛、捕鸟蛛的同源性分别为74.4%、73.7%、73.3%、73.7%、72.95%、78.41%、79.95%、76.67%、77.42%。系统进化分析显示，该序列首先与无脊椎动物JNK聚类，然后与脊椎动物聚类(见图2)，该物种的系统进化关系与物种的分类地位基本一致。

2.2 单环刺螠呼吸肠中JNK对硫化物暴露的反应

为了实现Western blot检测单环刺螠JNK对硫化物暴露的反应，本实验构建了单环刺螠JNK全长ORF的表达载体，将其转染大肠杆菌中成功表达出包涵体形式的JNK重组蛋白；镍柱纯化后的重组蛋白分子量约为47 kDa；所制备的JNK多克隆抗体滴度为1∶512 000，Western blot特异性检测其主带明显(见图3)。

Western blot结果显示，单环刺螠在50及150 μmol/L硫化物暴露期间，其呼吸肠内的JNK被持续性激活(见图4A、B)；其中硫化物处理0.5 h时，无论是50 μmol/L还是150 μmol/L硫化物实验组中单环刺螠呼吸肠细胞的磷酸化JNK含量均起始较对照组极显著提高(p<0.01)，且随着硫化物暴露时间的延长，磷酸化JNK含量持续极显著升高(见图4C)；150 μmol·L-1硫化物实验组于暴露48 h时，P-JNK含量达到最高，是对照组的10.2倍；50 μmol/L硫化物处理组于暴露72 h时，P-JNK含量达到最高，是对照组的7.82倍。此外，除去硫化物暴露72 h，其它各硫化物暴露时间点的P-JNK含量均是150 μmol/L处理组高于同一时间点50 μmol/L处理组的P-JNK含量。然而，2个不同浓度硫化物暴露各组单环刺螠呼吸肠细胞中的JNK蛋白总量组均未见发现有明显的显著性差异(见图4D)。

(黑色区代表氨基酸同源性为100%，深灰色区代表氨基酸的同源性为75%以上，浅灰色区代表氨基酸的同源性为50%；上划线处分别显示4个保守的JNK结构域。Black shaded regions are 100% homologous sequences, dark gray regions are 75%, light gray regions are 50%. Conserved Glycine-rich loop (P-loop), catalytic loop, common docking (CD) domain and activation loop are indicated in upline.) GenBank注册号:Aplysiacalifornica(NP_001191547),Cerapachysbiroi(EZA48912),DanioRerio(NP_001032790),Gallusgallus(XP_004941164),Homosapiens(NP_620446.1),Musmusculus(NP_033184),Stegodyphusmimosarum(KFM65023),Xenopus(Silurana)tropicalis(NP_001123415),Zootermopsisnevadensis(KDR18179).

图1不同物种JNK氨基酸序列同源性的多序列比对

Fig.1Multiple sequence alignment of JNK amino acid sequence among different species

图2　不同物种JNK同源性的聚类分析

(A. JNK蛋白的表达纯化；B. JNK多克隆抗体的特异性检验；1：蛋白分子量标准；2：未诱导重组菌；3：诱导3 h后总蛋白；4：诱导3 h后包涵体；5：诱导3 h后上清；6：Ni2+-NTA柱纯化后蛋白。 A.Expression and purification of theU.unicinctusJNK recombinant protein B. analysis of the anti-JNK specificity；1: protein marker; 2: non-induced product of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 3: induced product after 3 h of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 4: inclusion body of induced product after 3 h of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 5: supernatant of ultrasonicated induced product after 3 h of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 6: Ni2+-NTA purified target protein.)

图3单环刺螠JNK重组蛋白的表达纯化和抗体特异性分析

Fig.3Expression and purification of theU.unicinctusJNK

recombinant protein and analysis of the anti-JNK specificity

(A和B：Western blot检测；C：根据A、B两图所做的JNK总蛋白含量的光密度分析；D: 根据A、B图所做的磷酸化JNK蛋白含量的光密度分析。数据用平均数±标准误来表示(n=3)。**代表与对照组相比呈极显著性差异(P<0.01)。 A and B: Western blot detection; C: Denstiometric analysis of total-JNK content based on the results of A and B; D Denstiometric analysis of p-JNK content based on the results of A and B. Data are shown as the mean ± S.E.M. (n=3). ** indicates extremely significant difference (P<0.01) between the sulfide groups and the control group.)

图4硫化物暴露下单环刺螠呼吸肠中JNK总蛋白水平及磷酸化激活水平的WB检测

Fig.4Western blotting analysis of total-JNK and p-JNK amount in hindgut of U. unicinctus exposed to sulfide

JNK信号通路是真核生物细胞中重要的一条信号通路，它可被细胞因子如白介素1(IL-1)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)以及多种理化因子激活，参与细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞增殖与分化以及细胞凋亡等过程[18]。本文使用RACE技术获得了单环刺螠的1个全长cDNA序列，其推导的氨基酸序列中含有4个高度保守的真核生物JNK特征结构域，即富甘氨酸环、催化环、通用锚定结构域和含有双磷酸化位点(TPY)的激活环，并且与GenBank数据库中已有的JNK有高的同源性，初步推断其为单环刺螠的JNK全长cDNA。系统进化分析结果显示，该序列首先与无脊椎动物的JNK聚类，然后再与脊动物JNK聚类，表明单环刺螠JNK基因的进化地位与经典分类基本一致。

本实验结果显示，当单环刺螠暴露在50和150 μmol/L硫化物环境中时，其呼吸肠中的JNK蛋白表达总量均未见显著性增加，但其磷酸化JNK含量均显著提高，表明单环刺螠呼吸肠主要通过JNK激活水平而非蛋白表达水平的提高来应对环境硫化物的应激。有学者指出，JNK信号通路既参与细胞凋亡调控又与细胞存活相关[19]，最终体现哪一个细胞过程的调控可能与JNK激活时间的持续长度有关系。通常由细胞因子诱导的瞬时JNK激活与细胞的存活有关，而许多环境应激引起的JNK长效激活主要与细胞的凋亡或其它形式的细胞死亡(坏死、自我吞噬)相关[20-22]。Wang等[23]发现，用甲基苯丙胺诱导SH-SY5Y(神经母细胞瘤)细胞凋亡时，ERK、JNK磷酸化水平明显提高，而用抑制剂SP600125抑制JNK活性后，细胞凋亡明显减少；Adhikari和Bhatia[24]报道H2S可引起人胰腺腺泡细胞中JNK的长效激活，进而导致该细胞的凋亡。本实验中，单环刺螠暴露在50 μmol/L硫化物中其呼吸肠JNK的激活量随着暴露时间的延续持续性升高，这与上述在SH-SY5Y细胞和胰腺腺泡细胞中的结果类似。据此推测单环刺螠呼吸肠中的JNK持续性激活可能参与细胞凋亡的调控。

参考文献：

[1]Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades[J]. Nature, 2001, 410(6824): 37-40.

[2]Johnson G L, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases[J]. Science, 2002, 298(5600): 1911-1912.

[3]Gaitanaki C, Kefaloyianni E, Marmari A, et al. Various stressors rapidly activate the p38-MAPK signaling pathway in Mytilus galloprovincialis (Lam.)[J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2004, 260(1): 119-127.

[4]Kyriakis J M, Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation[J]. Physiological Reviews, 2001, 81(2): 807-869.

[5]Raingeaud J, Gupta S, Rogers J S, et al. Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(13): 7420-7426.

[6]Zanke B W, Boudreau K, Rubie E, et al. The stress-activated protein kinase pathway mediates cell death following injury induced by cis-platinum, UV irradiation or heat[J]. Current Biology, 1996, 6(5): 606-613.

[7]Rebholz B, Kehe K, Ruzicka T, et al. Role of NF-κB/RelA and MAPK pathways in keratinocytes in response to sulfur mustard[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2008, 128(7): 1626-1632.

[8]Samet J M, Graves L M, Quay J, et al. Activation of MAPKs in human bronchial epithelial cells exposed to metals[J]. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 1998, 275(3): L551-L558.

[9]Osipov R M, Robich M P, Feng J, et al. Effect of hydrogen sulfide on myocardial protection in the setting of cardioplegia and cardiopulmonary bypass[J]. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery, 2010, 10(4): 506-512.

[10]Papapetropoulos A, Pyriochou A, Altaany Z, et al. Hydrogen sulfide is an endogenous stimulator of angiogenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(51): 21972-21977.

[11]Du J, Hui Y, Cheung Y, et al. The possible role of hydrogen sulfide as a smooth muscle cell proliferation inhibitor in rat cultured cells[J]. Heart and Vessels, 2004, 19(2): 75-80.

[12]Lan A, Liao X, Mo L, et al. Hydrogen sulfide protects against chemical hypoxia-induced injury by inhibiting ROS-activated ERK1/2 and p38MAPK signaling pathways in PC12 cells[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e25921.

[13]张志峰, 王思锋, 霍继革, 等. 单环刺螠对硫化物暴露的呼吸代谢适应[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2006, 36(4): 639-644.

Zhang Z F, Wang S F, Huo J G. Adaptation of Respiratory metabolism to sulfide exposure inUrechisunicinctus[J]. Periodical of Ocean University of China, 2006, 36(4): 639-644.

[14]Wang S, Zhang Z, Cui H, et al. The effect of toxic sulfide exposure on oxygen consumption and oxidation products inUrechisunicinctus(Echiura: Urechidae)[J]. Journal of Ocean University of China, 2010, 9(2): 157-161.

[15]Ma Z, Bao Z, Wang S, et al. Sulfide-based ATP production inUrechisunicinctus[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2010, 28: 521-526.

[16]Ma Y B, Zhang Z F, Shao M Y, et al. Sulfide: quinone oxidoreductase from echiuran wormUrechisunicinctus[J]. Marine Biotechnology, 2011, 13(1): 93-107.

[17]霍继革, 张志峰, 胡晓丽, 等. 硫应激单环刺螠差异表达的初步研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2007, 37(3): 457-462.

Huo J G, Zhang Z F, Hu X L. Preliminary analysis of gene expression differences in sulfide stressedUrechisunicinctus[J]. Periodical of Ocean University of China, 2007, 37(3): 457-462.

[18]Cline J D. Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters1[J]. Limnology and Oceanography, 1969, 14(3): 454-458.

[19]Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades[J]. Nature, 2001, 410(6824): 37-40.

[20]Ip Y T, Davis R J. Signal transduction by the c-Jun N-terminal kinase (JNK)—from inflammation to development[J]. Current Opinion in Cell Biology, 1998, 10(2): 205-219.

[21]Reinhard C, Shamoon B, Shyamala V, et al. Tumor necrosis factor α-induced activation of c-jun N-terminal kinase is mediated by TRAF2[J]. The EMBO Journal, 1997, 16(5): 1080-1092.

[22]Almeida E A C, Ilié D, Han Q, et al. Matrix survival signaling from fibronectin via focal adhesion kinase to C-Jun Nh2-terminal kinase[J]. The Journal of Cell Biology, 2000, 149(3): 741-754.

[23]Ventura J J, Hübner A, Zhang C, et al. Chemical genetic analysis of the time course of signal transduction by JNK[J]. Molecular Cell, 2006, 21(5): 701-710.

[24]Wang S F, Yen J C, Yin P H, et al. Involvement of oxidative stress-activated JNK signaling in the methamphetamine-induced cell death of human SH-SY5Y cells[J]. Toxicology, 2008, 246(2): 234-241.

[25]Adhikari S, Bhatia M. H2S-induced pancreatic acinar cell apoptosis is mediated via JNK and p38 MAP kinase[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2008, 12(4): 1374-1383.

责任编辑高蓓

Response of JNK Pathway in the Hindgut ofUrechisunicinctusAfter Sulfide Stress

LIU Shu-Ren, LIU Xiao-Long, LI Yue, MA Xiao-Yu, ZHANG Zhi-Feng

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract:JNK pathway is a subpathway of MAPK pathways and involves in directing cellular responses to diverse stimuli in organisms. In this study, molecular characteristics of JNK and its response to sulfide stress were examined in the hindgut of Urechis unicinctus, a species of Echiura which habitats U-shape burrow of marine coast. Urechis unicinctus, a species of Echiura, inhabits marine sediments, especially subtidal mudflats and intertidal in China, Russia, Korea and Japan. It has been reported that the worm U. unicinctus may encounter sulfide exposure in its habitat and can tolerate high concentration sulfide based on the previous researches from the cytological characteristics of tissues, changes of heme compounds in coelomic liquid and sulfide oxidation of mitochondria in U. unicinctus exposed sulfide We obtained two fragments of 2 845 bp and 910 bp through 3’ and 5’-RACE PCR, depended on a 1 190 bp cDNA fragment from transcriptome of U. unicinctus. Then the full-length cDNA sequence was assembled which was 2 102 bp including an open reading frame (ORF) of 1 212 bp, a 160 bp 5’ untranslated region (UTR) and a 422 bp 3’UTR. A putative protein of amino acids with a theoretical pI of 7.15 and molecular mass of 45.9 kDa was encoded by the ORF. Five JNK conserved domains were contained in the deduced amino acid sequence, an activation loop with dual phosphorylation site (TPY), a glycine-rich loop, a catalytic loop and common docking domain, The deduced JNK amino acid sequence presented typical characteristics of JNK family. BLAST analysis indicated that the deduced amino acid sequence was highly homologous with other known JNK homologues, 81.9% identical to Cerapachys biroi, 79% to Zootermopsis nevadensis and 78% to Mus musculus. A phylogenetic tree was constructed based on amino acid alignment using the MEGA program, and it was observed that U. unicinctus JNK clustered primarily with Stegodyphus mimosarum and formed a sister group to Cerapachys biroi and other JNKs. On the whole, the relationships displayed in the phylogenetic tree were generally in accordance with classic taxonomy. Western blot detection indicated that no significant change was presented in total protein content of JNK when the worm was exposed to sulfide. But the content of active phospho-JNK(p-JNK) was significantly increased in U. unicinctus hindgut during the experiment, which was 10.2-fold higher in 150 μmol/L group at 48 h post-exposure than that of control. Our findings suggested that U. unicinctus JNK is conservative evolutionally and the JNK pathway plays a role in response to sulfide stress in U. unicinctus.

Key words:Urechis unicinctus； sulfide； JNK pathway

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150085

中图法分类号：Q257

文献标志码：A

文章编号：1672-5174(2016)02-076-07

作者简介：刘树人(1988-)，男，硕士。研究方向：海洋生物学。❋❋通讯作者：E-mail：zzfp107@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-03-18；

修订日期：2015-04-26

基金项目：❋国家自然科学基金面上项目(31372506)资助

引用格式：刘树人， 刘晓龙， 李岳， 等. 单环刺螠呼吸肠JNK通路对硫化物的应激反应[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2016, 46(2): 76-82.

Supported by National Natural Science Foundation of China(31372506)