siRNA沉默胸腺素β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响

谢红梅，孟祥宇，孙天霞，张丽轩，赵　雨，曲 毅,2*

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春 130117；2.吉林省食品药品安全监测中心，长春 130033)

siRNA沉默胸腺素β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响

谢红梅1，孟祥宇1，孙天霞1，张丽轩1，赵雨1，曲 毅1,2*

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春 130117；2.吉林省食品药品安全监测中心，长春 130033)

摘要：目的利用siRNA干扰技术研究胸腺素β4(Tβ4)基因沉默对鹿茸间充质干细胞(MSC)增殖的影响。方法鹿茸MCS分为阴性对照组、siRNA-Tβ4转染组2组。MTT检测MSC增殖的变化，Real-time PCR检测ILK、AKT及CyclinD1 mRNA表达量差异变化，Western blot检测AKT及P-AKT蛋白含量变化。结果siRNA-Tβ4转染组MSC增殖受到显著抑制(P<0.01)；siRNA-Tβ4转染组ILK、CyclinD1 mRNA表达量下调，AKT mRNA表达量不变；siRNA-Tβ4转染组总AKT蛋白含量无变化，P-AKT蛋白含量减少。结论 Tβ4基因沉默能显著抑制MSC增殖，并可能通过下调ILK、P-AKT及细胞周期相关蛋白CyclinD1从而抑制MSC细胞增殖。

关键词：RNA干扰；Tβ4；间充质干细胞；ILK/AKT信号通路

鹿茸具有强壮机体、抗衰老、增加机体免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗溃疡、增强中枢神经系统和心脑血管系统等药理作用[1-4]。前期研究[5-8]发现，在鹿茸快速生长时期，Tβ4高度表达。Tβ4是一个由43个氨基酸组成的小分子多肽，存在于大多数哺乳动物细胞中，可以促进内皮细胞迁移、加速血管生成、降低炎症反应、抑制凋亡和氧化损伤。鹿茸的生长依赖于鹿茸间充质干细胞(MSC)的增殖与分裂。本研究以MSC为模型，通过RNA干扰技术，沉默MSC的Tβ4基因，观察MSC 增殖及ILK/AKT信号通路相关蛋白表达的变化，探讨Tβ4沉默对MSC增殖的影响及其可能的机制，旨在为鹿茸快速生长研究探索新的途径。

1材料

1.1主要试剂鹿茸间充质干细胞由本实验室保存。Tβ4小干扰RNA(siRNA-Tβ4)和CY3-阴性对照小干扰RNA均为上海吉玛基因股份有限公司设计合成。MTT为美国Amresco公司产品。DMEM高糖培养基、胎牛血清为美国Gibco公司产品。兔来源 p-AKTser473一抗和兔来源AKT1一抗均购买于Cell Signaling公司。鼠来源Tublin一抗、兔二抗和鼠二抗均购买Abcam公司。ECL显色剂购自碧云天公司。

1.2siRNA的合成据前期获得的鹿茸Tβ4mRNA 序列和siRNA设计原则，鹿茸Tβ4mRNA的siRNA序列为：正义链GCAUAGGGCGCAUAUATT；反义链UAUAUGCGCGCUCCUAUGCTT；阴性对照为吉玛公司提供的错义siRNASCR序列。

2方法

2.1MSC细胞株的培养及转染MSC细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长密度达到70%～80%时，0.25%胰酶消化，离心去胰酶。并用无血清无抗性的DMEM稀释细胞，调整细胞浓度为5×104cells/L，应用电转法进行电转染，siRNA浓度为100 nmol/L。转染后细胞分别接种96孔和6孔板,用于后续的细胞增殖检测和信号通路研究。96 孔培养板每孔100 μL，每组6个复孔。6 孔培养板每孔2 mL，每组3个复孔。

2.2MTT检测细胞增殖抑制率转染6 h后，更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基。实验分为阴性对照组和siRNA- Tβ4转染组。转染48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，培养箱内继续孵育4 h后置于酶标仪上，在490 nm 波长下测各组吸光度(A)值。2.3Real-time PCR检测ILK、AKT及CyclinD1 mRNA表达量差异变化用TRIzol法提取MSC细胞总RNA，反转录cDNA为模板，Tβ4以F:AAAACGGAAACGCAAGA、R:GATTTCACTGTCGTCCCAC；内参基因β-Actin以F:CACCACAGCCGAGCGGGAAAT、R:CCGTGTTGGCGTAGAGGT为扩增引物进行Real-time PCR扩增，在进行Real-time PCR时对照组和实验组均设置3组平行，利用2-Ct方法计算Tβ4基因在对照组和实验组相对表达量。Real-time PCR检测重复3次。

2.4Western blot检测AKT及P-AKT蛋白含量变化提取细胞总蛋白后，经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，一抗37 ℃孵育2 h，加入二抗室温孵育1 h，ECL避光显色，检测AKT及P-AKT蛋白的表达，Tubulin为内参。

2.5统计学分析数据分析用SPSS 19.40统计软件，采用独立样本t检验进行差异显著性检验。

3结果

3.1MTT检测siRNA- Tβ4转染MSC后增殖影响结果表明，siRNA- Tβ4转染组MSC增殖受到显著抑制，抑制率为(18.450 1±0.401 7)%。与阴性对照组比较，P<0.01。

3.2Real-time PCR检测siRNA-Tβ4转染MSC后AKT、CyclinD1及ILK表达影响结果表明，Real-time PCR检测siRNA-Tβ4转染组ILK、CyclinD1 mRNA表达量明显下调，与阴性对照组比较，P<0.01;AKT表达量变化与阴性对照组比较，无统计学意义。

3.3Western blot检测AKT及P-AKT蛋白含量变化结果显示，siRNA-Tβ4转染组相对于对照组总的AKT蛋白含量无明显变化，而P-AKT明显减少，说明siRNA-Tβ4干扰的Tβ4表达促使磷酸化的AKT减少。

4小结

本实验用siRNA干扰MSC中Tβ4表达后，发现MSC的增殖被明显抑制，表明Tβ4和MSC增殖密切相关，Tβ4在鹿茸快速生长中可能起重要调控作用。

在ILK/AKT信号通路中，当ILK被激活时，将引起下游分子PKB、AKT或GSK-3的磷酸化效应，产生级联反应影响下游基因表达，最终对细胞增殖和存活产生影响[9-10]。本研究表明Tβ4被沉默后，MSC中的ILK和CyclinD1 mRNA表达量明显下调，而AKT尽管在mRNA水平未发生表达变化，但翻译后蛋白的磷酸化水平明显下降。

本实验结果进一步表明，Tβ4可以促进MSC增殖，可能的机制为激活ILK，进而活化AKT，促进下游CyclinD1的表达。此研究为后续鹿茸快速生长机制研究了奠定基础。

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Effect of siRNA-mediated thymosin β4silence on proliferation in mesenchymal stem cell

XIE Hongmei1,MENG Xiangyu1,SUN Tianxia1,ZHANG Lixuan1,ZHAO Yu1,QU Yi1,2*

(1.Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug,Changchun 130033,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of siRNA-mediated thymosin β4(Thymosin β4,Tβ4) silence on proliferation in activated mesenchymal stem cell(mesenchymal stem cell,MSC) and discuss the possible mechanism.MethodsMSC cells were divided into 2 groups:negative control group and siRNA-Tβ4 transfection group.The siRNA-Tβ4 was transfected into MSC cells and cell proliferation was measured by MTT,Real-time PCR detection ILK,AKT and CyclinD1mRNA expression quantity change,Western blot detection AKT and P-AKT protein content changes.ResultsMSC proliferation was significantly inhibited in siRNA-Tβ4 transfection group(P<0.01);Expression of the ILK,CyclinD1 mRNA of MSC transfected with siRNA-Tβ4 is reduced,AKT quantity remains the same(P<0.01);The siRNA-Tβ4 transfection group no change in total AKT protein,P-AKT protein content decreased.ConclusionThe siRNA-mediated Tβ4 silence significantly inhibits MSC proliferation by up regulating the ILK,p-AKT and CyclinD1expression in MSC.

Keywords：RNA interference;Tβ4;mesenchymal stem cell;ILK/AKT signaling pathway

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.008

基金项目：吉林省科技发展计划项目(20140622003JC)；吉林省科技发展计划项目(20130101142JC)。

作者简介：谢红梅(1989-)，女，硕士研究生，主要从事中药学研究。

*通信作者：曲毅，女，博士，助理研究员，电话-(0431)86172331，电子信箱-quyi1229@163.com

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2016)03-0462-03

(收稿日期:2016-03-21)