Aβ3-10重复片段质粒免疫接种AD鼠后对脑内BACE1的影响☆

袁裕钧胡细枚宋婷尹静茹郑东明马英

·论 著·

Aβ3-10重复片段质粒免疫接种AD鼠后对脑内BACE1的影响☆

袁裕钧*胡细枚*宋婷*尹静茹*郑东明*马英*

目的探讨Aβ3-10重复片段质粒免疫接种3月龄APPswe/PSEN1双转基因(AD)鼠脑内BACE1的影响。方法应用Aβ3-10重复片段质粒免疫3月龄APPswe/PSEN1双转基因鼠，同等剂量的PBS免疫对照组及C57BL/6J组小鼠，各组小鼠均在免疫后2、4、6次后通过RT-PCR法检测BACE1 mRNA水平，Western blotting法检测BACE1/GFAP/NF-κB蛋白水平，免疫组化法观察Aβ1-42脑内分布情况。水迷宫检测其行为学改变。结果在免疫2次后BACE1 mRNA表达水平C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（F=4.649,P=0.021）；免疫4次Aβ3-10组＜C57BL/6J组＜对照组（F=115.683,P=0.001）；免疫6次C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（F=86.600,P＜0.001）。BACE1的蛋白表达水平在免疫2、4、6次后C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（F=432.843,P＜0.001;F= 57.673,P＜0.001;F=26.550,P=0.001),NF-κB的蛋白表达水平在免疫2次后C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（F=109.127,P＜0.001）；免疫4,6次后Aβ3-10组＜C57BL/6J组＜对照组（F=30.301,P＜0.001；F=129.967，P＜0.001）。GFAP的蛋白表达水平在免疫2、4、6次后C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（F=27.782,P=0.001;F= 26.132,P=0.001;F=26.450,P=0.001）；Aβ1-42在脑内的分布C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（皮质：F=5.395,P= 0.021;F=47.135,P=0.000;F=25.306,P=0.000,海马：F=11.023,P=0.002;F=14.936,P=0.001;F=50.132,P= 0.000）。总潜伏期C57BL/6J组＜Aβ3-10组＜对照组（F=8.938,P=0.016;F=5.745,P=0.04;F=7.073,P=0.017）。结论Aβ3-10重复片段质粒可以影响脑内BACE1的表达，影响Aβ产生，改善空间记忆能力。

质粒 免疫疗法 β-分泌酶（BACE1）阿尔茨海默病 β-淀粉样蛋白

1907年，Alois Alzheimer在德国Tubingen的一次会议中首次报告1例病例，其典型临床症状表现为记忆障碍及行为改变，病理表现为粟粒样小体（淀粉样板块）和致密纤维束（神经纤维缠结），多年后由Kraepelin命名为阿尔茨海默病（AD）[1]。AD的病理机制很复杂，病因也尚未明确，但有证据表明淀粉样前体蛋白（APP）的异常代谢在产生毒性Aβ的过程中发挥重要作用。ɑ-，β-，γ-分泌酶均参与APP代谢过程，APP在生理条件下被ɑ-分泌酶裂解产生可溶性非淀粉样神经片段（sAPPɑ），在β-分泌酶（BACE1）、γ-分泌酶的作用下产生Aβ[2-3]，因此推测BACE1，γ-分泌酶是预防和治疗AD的两大主要研究靶点。我们的实验重点探讨经质粒免疫治疗小鼠后是否能有效减少其脑内BACE1表达，减少Aβ的形成及改善认知功能。

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组将3月龄鼠分别分成3组（均购自中国医科大学动物部）：①Aβ3-10质粒组：转基因鼠，pcDNA3.1-(Aβ3-10)10-CPG 100µg（体积约100µL；②3月龄对照组：转基因鼠，PBS（灭菌、0.01 mol/L、pH 7.4）100µL；3月龄C57BL/6J组：PBS（灭菌、0.01 mol/L、pH 7.4）100µL，（文中略写为Aβ3-10组，对照组，C57BL/6J组）。每组15只鼠，雌性，共免疫6次，每个月免疫注射1次，部位为小鼠大腿内侧股四头肌。每次间隔1个月[4]。

1.2 质粒构建质粒pcDNA3.1-(Aβ3-10)10-CPG的构建由长沙赢润生物技术有限公司完成。Aβ 3-10-cpG序列片段由南京金斯瑞合成。采用克隆位点HindIII和EcoRI进行酶切，阳性质粒切出约300 bp左右的Aβ3-10-cpG片段带和约5.4 kb左右的载体带。将鉴定的阳性菌种送长沙赢润生物技术有限公司测序。

1.3 组织样本取材在分别免疫2、4、6次后1个月对每组小鼠进行检测，麻醉小鼠后分离大脑用于进一步检测。

1.4 BACE1的mRNA水平检测应用TRI试剂（Life technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA）按照操作说明提取总RNA。以β-actin为内参照，RT-PCR法测定BACE1mRNA相对表达量。用凝胶成像系统分析PCR产物电泳条带光密度值，表达水平以待测mRNA与β-actin mRNA的光密度值之比来表示。应用PowerScript逆转录酶（Invitro⁃gen，Camarillo,CA）合成cDNA的第一条链。应用Taq DNA聚合酶进一步扩增。最后相对定量分析用2－Δct计算。

1.5 BACE1,GFAP,NF-κB蛋白水平检测取冰冻标本数例，裂解剪碎组织，离心后取上清，酚试剂法测浓度。加入100 μL 5XBuffer,沸水变性5 min。SDS-PAGE电泳分离蛋白（每孔上样20 μL）；湿转至PVDF膜上，封闭2 h；加入抗BACE1抗体(AB5832 EMD Millipore Corporation,Temecula, CA92590,USA，1:500)；抗GFAP抗体（ab68428 ab⁃cam，USA，1:1000)；抗NF-κB p65抗体112A1021（ab13594 abcam，USA，1:500）4℃过夜，加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG（LOT571001100，北京鼎国昌盛生物技术有限公司，1:5000)，洗膜3次后应用Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统进行照相和条带密度扫描（上海天能），应用ImageJ（USA）软件进行灰度值测定用于统计分析，目标灰度值/内参灰度值作为相对表达量进行统计计算。

1.6 检测Aβ脑内的分布应用免疫组化SP法（ZA⁃GB-BIO，Catalog Number:70B12A）进行组织分析。常规二甲苯脱蜡，酒精脱水后水洗5次；3%双氧水37℃孵育10 min，PBS冲洗；抗原修复，冷却，PBS冲洗3次；封闭；滴加单克隆抗Aβ蛋白抗体（Sigma,USA,CloneBam-10,ProductNo. A5231），4℃过夜，PBS冲洗3次；滴加生物素标记辣根没标记的山羊抗兔IgG（LOT571001100，北京鼎国昌盛生物技术有限公司），37℃孵育30 min，PBS冲洗3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次；DAB显色，冲洗；苏木素复染，脱水，透明，干燥，中性树胶封片，计算Aβ沉积所占面积百分比。图像分析应用MetaMorph显微图像分析系统（USA）。1.7水迷宫实验检测是否有行为学损害，每次免疫接种结束后4周，采用Morris水迷宫恒温游泳池（淮北正华生物仪器设备有限公司http:// www.6062307.com）多方面记录并分析小鼠的学习及记忆能力。

1.8 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理与分析。呈正态分布的计量资料以（±s）表示，计量资料应用单因素分析，方差齐时选用LSD方法，方差不齐时选用Dunnett T3方法比较三组间差异。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 pCDNA3.1（+）-Aβ3-10-cpG载体构建与测序用HindIII和EcoRI双酶切重组质粒，切出约300 bp左右的rno-mir124片段带和约5.4 kb左右的载体带，如图1（箭头）所示。测序结果显示质粒DNA为成功构建pcDNA3.1-（Aβ3-10）10-CPG（图2）。

2.2 水迷宫测试结果Morris水迷宫测试结果如表1、2所示。经Aβ3-10免疫治疗AD小鼠可以改善其空间记忆能力。

2.3 RT-PCR法检测BACE1 mRNA水平如图3所示，免疫4,6次后对照组BACE1 mRNA表达均比Aβ3-10组、C57BL/6J组高，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

图1 pLVX-EN-rno-mir124酶切鉴定图 M：2K Plus II；1：pCD⁃NA3.1(+)-Aβ3-10-cpG经HindIII和EcoRI酶切结果

表1 3月龄小鼠总平均潜伏期(s)

2.4 小鼠脑内BACE1/GFAP/NF-κB蛋白水平如图4所示免疫2,4,6次后BACE1蛋白相对表达量在3组间有统计学差异（F=432.893，P=0.000;F= 57.673，P=0.000;F=26.550;P=0.001)，GFAP的蛋白相对表达量在3组间有统计学差异（F=27.782，P= 0.001;F=26.123，P=0.001;F=25.560;P=0.001)；NF-κB的蛋白相对表达量在3组间有统计学差异（F=109.127，P=0.001;F=30.301，P=0.001;F= 129.967,P=0.000)。

图2 pUC57-Aβ3-10-cpG测序比对图 Sequence 0：Aβ3-10-cpG序列；Sequence 2：pUC57-Aβ3-10-cpG.ab1序列

图3 BACE1 mRNA水平##：C57BL/6J组与对照组比较P＜0.01; **：Aβ3-10组与对照组比较P＜0.01

2.5 免疫组化法检测脑内Aβ分布情况图5为海马及皮层区Aβ沉积情况，经统计Aβ沉积所占面积百分比依次为：对照组＞Aβ3-10组＞C57BL/6J组，且均有统计学差异。

3 讨论

十多年前有5个研究小组经多次实验，均发现一种新型具有β分泌酶活性的天冬氨酸蛋白酶，后被起名为BACE或BACE1。BACE1在组织中广泛表达，比如在胰腺中BACE1的mRNA含量很高，但其作用是一种选择性的剪切变异体仅能裂解少量的APP，在脑内很多区域可以检测到BACE1 mRNA，其中在皮层的水平最高[5]。在AD脑中，BACE1表达及活性的增加影响了Aβ的沉积，有研究证实BACE1缺乏的小鼠脑内病理性淀粉样沉积明显减少[6]，这些发现更说明了BACE1在介导APP转化成Aβ过程中所发挥的重要作用，因此这也意味着BACE1成为了治疗AD的重要研究目标[7]。

BACE1的表达水平从转录到翻译受很多因素调节[8]，缺血，氧化应激和脑创伤均会增加BACE1的表达和活性[9]。暴露于应激状态下的AD小鼠模型中可以加速Aβ沉积及tau神经病变[10]，其中两种基因即APP，BACE1对其影响意义重大[11-12]。而在CORDNER等[13]研究进一步证明慢性应激可以降低脑内DNA的甲基化，增加BACE1的表达，因此形成一系列恶性关联，即应激-病理性Aβ-AD，并且他们的研究表明幼龄和老龄鼠均会出现此现象，但老龄鼠对应激的反应更敏感。

表2 小鼠空间探索实验结果（n=15）

表3 Aβ沉积所占面积的百分比（n=15）

BACE1除了介导产生Aβ外还参与很多重要的生理过程，包括活化神经元，参与髓鞘形成，指导轴索形成，活化突触前膜和保持认知行为[14]。BACE1的这些生理功能也是我们研制BACE1抑制剂的安全隐患[15]。有实验证明Aβ3-10重复片段质粒免疫转基因小鼠可以减少其炎症反应，改善小鼠空间及记忆能力，并且没有出现明显不良反应[4]。

通过文献我们了解免疫疗法是AD治疗的新发展，而在以往的研究中大多是探索及证实质粒免疫治疗的效果，并且我们的前期工作已经证实Aβ3-10重复片段质粒免疫接种AD鼠后可以产生抗Aβ抗体并且安全有效[4]。因此本文在继以往的研究基础上进一步探索质粒免疫治疗AD对BACE1的影响及其机制。结果显示，经过免疫治疗后的AD小鼠其脑内BACE1mRNA及蛋白的表达水平下降，GFAP，NF-κB的蛋白表达水平下降，Aβ沉积减少，小鼠的空间记忆能力也明显得到改善，提示Aβ的沉积多少与BACE1，GFAP，NF-κB的表达有关。YANG等[9]报告经质粒免疫可以降低小鼠脑内炎症反应，下调BACE1的表达及活性，GU等[16]证明通过质粒免疫可以降低NF-κB的活性从而使BACE1的表达及活性降低，减少了对APP的裂解。NF-κB是APP,BACE1，γ-分泌酶基因的转录因子，可以激活其活性，因此可以增加Aβ的产生[16]。本研究也证实经免疫治疗的AD小鼠脑内BACE1，GFAP，NF-κB的表达均有所下降，验证其机制为降低BACE1的表达，减少对APP的裂解从而减少Aβ产生[2,6];减少炎性反应，减少NF-κB活化，从而间接减少BACE1表达，减少Aβ产生[7,17]。在尸检AD患者神经元我们发现其神经纤维缠结和发育不全的神经突触中均有NF-κB的存在，并且NF-κB更可以被神经元周围斑块的Aβ激活。因此在BACE1介导的Aβ产生过程中NF-κB途径有着非同小可的作用[18]。

图4 Western blotting检测BACE1/GFAP/NF-κB蛋白表达及相对表达量 “-”表示未接受Aβ3-10免疫，“+”表示接受Aβ3-10免疫治疗，“A”为C57BL/6J组，“B”为Aβ3-10组，“C”为对照组“##”表示C57BL/6J组与对照组比较P＜0.01;“**”表示Aβ3-10与对照组比较P＜0.01

图5 小鼠海马与皮质中Aβ沉积情况（40×）A为Aβ3-10组，B为对照组，C为C57BL/6J组，“1”为免疫2次，“2”为免疫4次，“3”为免疫6次

综上所述Aβ3-10重复片段质粒对AD鼠脑内BACE1的表达水平具有一定影响，可直接影响BACE1的转录和翻译，从而使Aβ产生减少；另一方面可降低脑内炎症反应，降低NF-κB水平,从而间接影响BACE1介导APP的产生Aβ通路，减少Aβ产生，改善小鼠空间记忆能力。

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The effects of Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunotherapy on the BACE1 in the AD mice.

YUAN Yu⁃jun,HU Ximei,SONG Ting,YING Jingru,ZHENG Dongming,MA Ying.Department of Neurology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China.Tel:024-96615-28111.

Objective To explore the effects of Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunotherapy on BACE1 in AP⁃Pswe/PSEN1 double transgenic(AD)mouse brains.Method Aβ3-10 repeat fragment plasmid was used to immune 3 months APPswe/PSEN1 double transgenic mice.Equal amount of PBS was used to immune the control and C57BL/6J groups.RT-PCR method,Western blotting methods immunohistochemical method were used to detect BACE1 mRNA level,BACE1/GFAP/NF-κB protein levels and Aβ1-42distribution in the brain after 2,4 and 6 immunization injections in every group,respectively.Morris water maze was used to detect the changes of behaviors.Result After two injections, the BACE1 mRNA expression levels was,in a descent order,C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group（F=4.649, P=0.021）.After four injections,the BACE1 mRNA expression levels was,in a descent order,the Aβ3-10 group＜C57BL/6J group＜control group（F=115.683,P=0.001）;after six injections,the BACE1 mRNA expression levels was,ina descent order,the C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group(F=86.600,P＜0.001).After two,four and six injec⁃tions,the protein expression level of BACE1 was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group（F=432.843,P＜0.001;F=57.673,P＜0.001;F=26.550,P=0.001）;the protein expression level of GFAP was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group（F=27.782,P=0.001;F=26.132,P=0.001;F=26.450,P=0.001);and Aβ1-42distribution in the brain was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group(cortex：F=5.395,P=0.021;F=47.135,P=0.000;F=25.306,P= 0.000,hippocampus：F=11.023,P=0.002;F=14.936,P=0.001;F=50.132,P=0.000).The total latent period was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group(F=8.938,P=0.016;F=5.745,P=0.04;F=7.073,P=0.017).Conclu⁃sion Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunotherapy can affect the expression level of BACE1 and Aβ production,im⁃proving spatial memory.

Plasmid Immunotherapy β-secretase Alzheimer disease β-amyloid protein

R742.9

A

2016-07-28）

（责任编辑:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.11.005

☆ 国家自然科学青年基金（编号：81200834）；辽宁省自然科学基金（编号：2013021070）；沈阳市科学技术计划项目（编号：F10-205-1-10）

* 中国医科大学附属盛京医院（沈阳 110004）

E-mail:mayingwfdsy@163.com）