高效液相色谱法测定奶牛饲料中苯甲酸的方法研究

张 鑫 肖 琎 周 鑫 张思宇 张立田 刘 洋

（唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山 063000）

高效液相色谱法测定奶牛饲料中苯甲酸的方法研究

张 鑫 肖 琎 周 鑫 张思宇 张立田 刘 洋

（唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山 063000）

本实验建立了奶牛饲料中苯甲酸含量测定的高效液相色谱法，样品经甲醇溶液提取、C18固相萃取柱净化后，高效液相色谱分离测定。对粗料、精料以及TMR日粮的加标回收实验，回收率均在72.77～92.94%之间，相对偏差1.74～3.06%之间。本方法具有操作灵敏度高，净化效果好，适用范围广等特点，完全能够满足奶牛饲料中苯甲酸检测的需要。

饲料；苯甲酸；高效液相色谱法；固相萃取

苯甲酸是具有鳞片状或针状结晶的物质，以游离酸、酯或其衍生物的形式广泛存在于自然界中，是一种常见的饲料防腐剂。苯甲酸通过抑制细菌及霉菌等微生物细胞膜对氨基酸的吸收，并抑制细胞的呼吸酶系的活性，从而达到防腐的作用。[1]而奶牛饲料一般由粗料、精料和其他添加剂混合而成，成分复杂，对饲料中苯甲酸检测造成了一定的困难。本方法对粗料、精料以及TMR日粮中的苯甲酸分别进行了研究，旨在研发出一种准确，灵敏的检测方法，满足日常检测的需要。

1 材料和方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪，岛津公司LC-20AT配紫外检测器；电子天平，Sartorius公司；振荡器，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试剂

甲醇，HPLC级，ACS公司；亚铁氰化钾，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；乙酸锌，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；磷酸氢二钾，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；磷酸二氢钾，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；氢氧化钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；苯甲酸标准品，Dr.E；500mg/6mlC18固相萃取小柱，迪马科技。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为ODS-SP 250mm×4.6mm 5μ m，流动相：磷酸盐缓冲液（pH=6.7）+甲醇=90+10，流速为1.0ml/min，检测波长：230nm，进样量20μ l。

1.4 样品处理

称取3.00g样品至50ml离心管中，加入5mol/L氢氧化钠溶液1ml、20%甲醇20ml，涡旋混匀，振荡提取20min，再加入92g/L亚铁氰化钾2ml，183g/L乙酸锌2ml，混匀，5000r/min离心5min，收集上清液，调节pH值至3备用。C18固相萃取柱用甲醇5ml、水5ml活化，取5mL提取液过柱，5ml水淋洗，3ml 60%甲醇洗脱，洗脱液过0.45μ m滤膜上机检测。

2 结果与讨论

2.1 最佳波长的测定

取苯甲酸标准溶液于 190～600 nm 波长范围内进行扫描，结果发现苯甲酸在230nm附近有最大吸收，故选择230nm作为检测波长。

2.2 固相萃取条件的优化

通过对文献的查阅[2-4]，本方法选择了C18固相萃取柱净化样品。通过实验发现提取液的pH对固相萃取柱的过柱效果有影响。我们选择了不同pH值的标准溶液作为样品进行了实验，发现当pH为中性是C18固相萃取柱对苯甲酸的保留为0，回收率为0；而酸性环境下C18固相萃取柱对苯甲酸的保留增强，见表1。从表中可以看出，pH值为2和pH值为3的回收率接近，且为最高，但低pH值会对C18固相萃取柱有损坏，最终我们选择了pH值为3时进行固相萃取。

图1 苯甲酸标准溶液色谱图

图2 空白加标色谱图

图3 空白样品色谱图

表1 不同pH值下固相萃取的回收率

2.4 线性范围及最低检测限

配制浓度分别为1.0μ g/ml、5.0μ g/ml、10.0μ g/ml、25.0μ g/ ml、50.0μ g/ml、苯甲酸标准溶液，并进行色谱分析，以苯甲酸含量Y（μ g/ml）对峰面积X作图，得出苯甲酸回归方程Y=2.52×10-5X-0.14，相关系数r为0.9999。

2.5 方法测定低限的确定

对空白样品进行20次重复测定，按照3倍信噪比计算，得出方法测定低限均为5mg/kg。

2.6 精密度回收率

我们对奶牛配合饲料、青贮饲料、TMR日粮进行加标回收实验，加标浓度分别为5μ g/kg、10μ g/kg、50μ g/kg，即为方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限，依照样品处理方法测定，回收率及相对偏差见表。从表可见，3个加标浓度的苯甲酸在3种饲料中均有良好回收率和相对偏差。

张鑫（1983—），女，河北唐山人，硕士研究生，从事动物营养与饲料科学研究。