脂多糖内毒素联合甲基泼尼松龙建立骨坏死动物模型的血管内外变化

黄东海，霍业红，孙红英



脂多糖内毒素联合甲基泼尼松龙建立骨坏死动物模型的血管内外变化

黄东海，霍业红，孙红英＊

［摘要］目的通过对白兔先采用单次低剂量的脂多糖内毒素注射和随后三次高剂量的甲基泼尼松龙注射，利用不同的成像方式及病理学检查，来研究由激素性骨坏死动物模型的血管内外改变。方法实验组：11只32周龄雄性白兔；对照组：8只32周龄雄性白兔。实验组单次静脉内注射内毒素（10 μg/kg），24 h后，肌肉注射甲基泼尼松龙（20 mg/kg），重复3次。MRI动态观察内毒素注射前后双侧股骨的局部骨内灌注情况。收集内毒素注射前后的血液样本并做血液学检查。解剖和脱钙后的双侧股骨做显微CT下的微血管成像。对激素性骨坏死，血管内血栓形成和血管外骨髓脂肪细胞进行组织病理学检查。结果实验组91%的兔（10/11）出现骨坏死，且实验期间没有死亡。在骨坏死阳性白兔中，无论是干骺端和骨骺均发现了骨坏死病变的典型特征。在骨坏死阳性白兔所有骨样本中均未发现软骨下骨的塌陷。所有对照组骨样品中没有观察到组织病理学的改变。结论注射内毒素和随后高剂量注射甲基泼尼松龙所诱导的激素性股骨坏死实验动物中发现血管内和血管外均有改变。实施此诱导方案所产生的骨坏死高患病率且低死亡率，提示其在激素性骨坏死实验研究中有一定的可行性。

［关键词］成像；脂多糖内毒素；甲基泼尼松龙；诱导；骨坏死；动物模型

［作者单位］475000河南开封，解放军155医院骨科（黄东海，霍业红），消化内科（孙红英）

既往有两种常用的建立激素性骨坏死兔子模型的经典诱导方案。一种是使用单次高剂量注射甲基泼尼松龙，然而这种方法的骨坏死发生率较低［1］。另一种是两次大剂量的脂多糖内毒素和随后的三次高剂量的甲基泼尼松龙，诱发了较高的发病率，但同时也导致了实验动物高死亡率（50%）［2］。在对激素性骨坏死的干预策略中，有必要建立新的方案来诱导骨坏死病变，既有较高的骨坏死发生率，又有较低的动物死亡率。笔者尝试，单次注射低剂量脂多糖内毒素联合随后的三次高剂量甲基泼尼松龙注射的实验方法。为了确认上述方案建立激素性骨坏死动物模型的有效性，本研究使用传统的和先进的静态和动态生物成像方法，来分析致病事件、病理生理途径和结束点相关的骨坏死发病率和病死率。做了血管内血栓形成和血管外骨髓脂肪细胞的组织学检查，以及对凝血、纤溶和脂质运输做血液学评价；对于研究病理生理途径，用动态MRI和显微CT下的微血管成像来检查骨内血供系统的结构和功能；对激素性骨坏死的发病率和病死率分别用骨组织病理学和实验资料进行了审查。

1　材料与方法

1.1一般资料选择19只实验动物中心的雄性白兔，32周龄、体重3～4 kg，标准的实验室饮食。实验组的11只白兔单次静脉注射内毒素（10 μg/kg），随后，每间隔24h，肌肉注射1次甲基泼尼松龙（20 mg/ kg），共3次。对照组8只白兔注射0.9%的生理盐水。在甲基泼尼松龙注射后的6周里，动态观察骨坏死形成和坏死骨的修复过程［1，3］。最后一次注射甲基泼尼松龙6周后对两组兔均进行了安乐死。

1.2安乐死之前的评估

1.2.1血液学检查从每只禁食的白兔经耳廓动脉分别在注射内毒素前、第一次注射甲基泼尼松龙前和最后一次注射甲基泼尼松龙后24 h分别采取5 ml的血液样本，进行血栓前状态的评估［4，5］。

1.2.2动态MRI在内毒素注射前和最后一次注射甲基泼尼松龙后6周，用1.5T的MRI对双侧股骨近端和股骨远端行动态扫描［6］。

1.3安乐死后评估

1.3.1灌注和脱钙全身麻醉，在37℃条件下，用50 U/ml的肝素生理盐水，以20 mm/min的流速冲洗。若从腹腔静脉的切口流出清亮液体，则用10%的中性甲醛缓冲液（37℃）泵入脉管固定滋养骨骼肌样品。然后用肝素生理盐水冲洗脉管中的福尔马林，脉管中注射Microfil。然后用过量戊巴比妥钠使动物安乐死并储存在4℃下1 h，以确保微血管造影前造影剂的聚合。收集双侧股骨样品并用多聚甲醛（4%）固定，EDTA（10%，pH值7.4）脱钙［7，8］。

1.3.2微血管成像在有经验的显微CT专家的帮助下，每个骨样品的近端和远端分别插入一个PMMA样品管。股骨干长轴垂直固定于管的底部。从距离底部10 mm的基准线开始垂直于轴扫描，整个扫描长度为10 mm。用低通高斯滤波器去除噪声以做血管丛背景的分割。通过内置的脱钙样品中可自动重构的3-D图像脉管的“轮廓程序”，在每个填充有Microfil血管的二维（2-D）部分可半自动绘制轮廓，随后生成直方图显示血管大小的分布，并将颜色映射到3-D图像表面，可视化表示血管大小分布［8］。

1.3.3组织病理学微血管造影后，样本切片用苏木精-伊红染色（H&E），来评价骨坏死和计算脂肪细胞大小［1，2，12］。

1.4统计学方法使用SPSS10.0统计软件进行统计分析，采用t检验处理数据。P＜0.05为具有显著性差异。

2　结果

所有形成骨坏死的兔均观察到血管内血栓形成。骨坏死兔的血管外骨髓脂肪细胞显著大于对照组兔（P＜0.05）。与基值水平相比，组织型纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制剂1和活化部分凝血活酶时间显著降低，低密度脂蛋白/高密度脂蛋白显著增加（P＜0.05）。动态MRI显示，骨坏死兔的灌注指数“最大增强”显著下降（P＜0.05）。显微CT下的微血管成像显示：骨坏死样本中干血管形成堵塞。总体上，91%的兔（10/11）出现骨坏死，且实验期间没有死亡。在骨坏死阳性白兔中，无论是干骺端和骨骺均发现了骨坏死病变的典型特征。在骨坏死阳性白兔所有骨样本中均未发现软骨下骨的塌陷。所有对照组骨样品中没有观察到组织病理学的改变。

3　讨论

3.1激素性骨坏死的血管内发病机制通过这个实验，骨坏死的兔子在注射内毒素后，纤维蛋白溶解倾向以及凝血功能与基值水平都出现明显的降低。这一现象说明内毒素引起了血液高凝倾向和低纤维蛋白溶解倾向［9］。本研究结果提示与人类激素性骨坏死在发生软骨下骨塌陷之前存在的与发病事件和发病机制上的相似。在骨坏死的骨上黏附性骨生成以及在死骨周围发现的纤维性肉芽组织都与人体骨坏死病灶类似［10］。

3.2激素性骨坏死的血管外骨髓发病机制尽管内毒素引起的脂肪代谢紊乱经常发生，可是其产生机制目前还不清楚。在本实验中，骨坏死兔在注射内毒素后，血浆LDL/HDL值明显比基值高，它说明脂肪向外周组织的转达倾向在骨坏死家兔中占有主导地位，表明内毒素与甲基泼尼松龙对骨髓的脂肪堆积存在协同加强作用［11，12］。

3.3血管结构微血管造影检查显示骨坏死区域的病理生理存在许多与血管新生联系的不连续的小血管样结构以及许多弥散性的无定型的渗漏样结构，说明参与骨坏死修复过程的新生血管的功能与结构的异常。本实验提示能够当做一个评估指标来评估潜在的干预措施是否能够加速坏死病灶的修复。

总之，通过用单次低剂量注射内毒素和随后三次高剂量注射甲基泼尼松龙所诱导的激素性股骨坏死实验中发现血管内和血管外均有改变，对兔实施此诱导方案所产生的高骨坏死患病率且低死亡率，可对以后激素性骨坏死实验研究提供一定指导。

参考文献

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［2015-11-13收稿，2015-12-10修回］

［本文编辑：韩仲琪］

个案与短篇

The changes of intra- and extra-vessels of bone necrosis animal model induced by combination of LPS and methylprednisolone

HUANG Dong-hai①，HUO Ye-hong，SUN Hong-ying.①Dept. of Orthopedics，No. 155 Hospital of Chinese PLA，Kaifeng，Henan 475000，China

［Abstract］Objective The rabbits were injected with a single and low dose of lipopolysaccharide（LPS）and three doses of methylprednisolone to establish bone necrosis model，so as to study the changes of vessel＇s intra- and extertal by using different imaging modalities and pathological examination. Methods The experimental group：eleven 32 -week -old male white rabbits；control group：eight 32 -week -old male white rabbits. The experimental group of single intravenous injection of LPS（10 μg/kg），24 hours after the injection of methylprednisolone（20 mg/kg），repeated 3 times. MRI dynamic observation was taken before and after LPS injection in bilateral femoral bone perfusion；the blood samples before and after LPS injection were collected and taken blood examination. Microvascular imaging under CT was taken for decalcified bilateral femur. Steroid induced osteonecrosis，thrombosis and vascular-outside bone marrow fat cells received histopathological examination. Results In the experimental group，10 rabbits had bone necrosis，but no death. In the rabbits with bone necrosis either the metaphysis and epiphysis were found in the typical characteristics of bone necrosis；in all samples of the rabbits with bone necrosis the collapse of the subchondral bone was all not found. The control group was not observed with samples of bone tissue pathological changes. Conclusion Both intra- and extra-vascular events are found attributing to the steroid -associated ON in this study. Both high ON incidence and no mortality in rabbits treated with this inductive protocol suggested its effectiveness for further studies on evaluation of therapeutic efficacy of interventions developed for prevention of steroid-associated ON.

［Key word］Imaging；Lipopolysaccharide（LPS）；Methylprednisolone；Induction；Osteonecrosis；Animal model

［中图分类号］R681

［文献标志码］A

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.06.021

［通讯作者］孙红英，Email：changhr2008@163.com