发酵液中的L-色氨酸分离纯化研究

杜金鼎 高凤云 李 文

(山东鲁抗生物制造有限公司,山东济宁 273500)

发酵液中的L-色氨酸分离纯化研究

杜金鼎 高凤云 李 文

(山东鲁抗生物制造有限公司,山东济宁 273500)

L-色氨酸在天然蛋白质内含量比较丰富,是人与动物生长发育所必需氨基酸之一,并且随着其效用的研究发现,现在已经被广泛的应用到食品、医药与饲料等多个方面。本文结合发酵液中L-色氨酸分离纯化试验对工艺要点进行了简要分析。

发酵液;L-色氨酸;分离纯化

经过分离纯化在发酵液内获得L-色氨酸是现在比较新型的而一种生产方法，包括离子交换法、结晶法等，在实际作业中具有工艺简单、污染小、能耗低以及成本低等优点。为提高L-色氨酸收率，需要总结以往生产工艺，对分离纯化过程进行分析，确定影响因素，然后采取措施来做更进一步的优化，提高产品提取率。

1 L-色氨酸特点分析

L-色氨酸即L-氨基-吲哚基丙酸，分子式为C11H12O12N2，呈白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，无臭或微臭，微溶于乙醇。其在碱液内稳定性比较高，但是遇到其他氨基酸或糖类则容易分解。L-色氨酸作为人与生物生命活动必需氨基酸之一，对生长发育和新陈代谢具有重要作用。并且还可以将其应用到医药方面，例如氨基酸输液、调节脑代谢等。L-色氨酸同时也是部分植物蛋白所缺乏氨基酸种类之一，利用其对来制作食品或饲料添加剂，对提高植物蛋白利用率具有重要意义，现在已经成为蛋氨酸与赖氨酸之后又一饲料添加氨基酸。L-色氨酸基于其性能特点，现在已经被广泛的用于多个领域，为进一步提高产品收率，需要就现有生产工艺进行分析，采取措施对所存不足进行优化，控制成本的同时，提高生产效率。

2 L-色氨酸生产技术

2.1 化学合成法

应用化学合成法生产L-色氨酸，常用原料主要包括苯肼和吲哚两种，反应后得到DL消旋体色氨酸，通过进一步光学导构体拆分，便可得到生物可以利用的L-色氨酸[2]。此种方法在实际操作上工艺要求比较严格，且受原材料限制大，在很大程度上遏制了其在工业领域的发展应用。

2.2 蛋白质水解法

蛋白质水解法生产L-色氨酸，需要将血粉、毛发与废蚕丝等富含L-色氨酸的物料作为原料，经过碱水解法或者酶水解法处理，水解反应生成L-色氨酸。此种方法在实际应用中具有周期长、工艺复杂以及产品复杂等特点，并且原料来源限制大，生产所得L-色氨酸数量有限，并不适合工业生产。

2.3 微生物法

即前体发酵法，将葡萄糖作为碳源，加入邻氨基苯甲酸、吲哚、L-丝氨酸等前体物，通过微生物色氨酸合成酶系转化前体生成得到L-色氨酸。为保证产物质量，反应时需要控制前体物所加数量，避免添加量过多抑制微生物的生长，可以选择用分批少量或流加方法。虽然得率比较高，但是因为收反馈调节抑制比较大，前体物成本较高，所需投资比较大。其中，利用微生物体内L-色氨酸生物合成酶系催化生产L-色氨酸即酶法，生产所得产品纯度高、浓度高、生产周期短、副产物少并且易于分离纯化，是工业生产L-色氨酸最为常见的一种方法。

3 发酵液内L-色氨酸分离纯化试验分析

3.1 材料设备

材料：L-色氨酸基因工程菌接种于M63培养基发酵得到发酵液；离子交换树脂；L-色氨酸则为日本进口分装，其他试剂均为分析纯试剂。

设备：RF-5301型荧光分光光度计、LKB2132蠕动泵、高速台式冷冻离心机、恒温振荡器以及氨基酸自动分析仪。

3.2 工艺方法

3.2.1 材料预处理

对树脂和发酵液进行预处理，其中发酵液可以利用高速台式冷冻离心机，按照10000r·min-1离心处理20min，将发酵液内含有的菌体与蛋白质等杂质全部清除干净。

3.2.2 静态实验

（1）吸附实验

称取一定量预处理的树脂置于100ml具塞三角瓶内，加入适量L-色氨酸溶液，以100r·min-1与室温条件下在摇床上振荡，结束后取样分析，溶液内L-色氨酸浓度不变时为吸附平衡。计算树脂对L-色氨酸平衡吸附量：Q=（C0-C）×V/W，其中C0表示吸附前溶液中L-色氨酸质量浓度，单位g·L-1；C表示吸附后溶液内L-色氨酸质量浓度，单位g·L-1；V表示溶液体积，单位L；W表示湿树脂质量，单位g。

（2）洗脱实验

称取适量吸附平衡后树脂置于100ml具塞三角瓶内，然后接入适量洗脱液，放置摇床上以100r·min-1与室温条件下振荡，结束后取样阀内洗，当溶液内L-色氨酸浓度不变时为洗脱平衡。

3.2.3 动态实验

（1）吸附实验

称取6g湿树脂置于离子交换柱内，以6g·L-1的L-色氨酸溶液上柱，分别以0.5、1、2ml·min-1流速吸附。当柱底流出液与上柱液浓度相同时停止上柱，对流出液进行分部收集测定，确定最佳吸附流速。

（2）洗脱实验

选择0.5、1、2mol·min-1的氨水，对吸附饱和树脂进行洗脱，按照0.5、1、2ml·min-1洗脱速度处理，并对流出液进行分部收集测定，确定最佳氨水浓度与洗脱速度。

3.3 过程分析

3.3.1 流速

选择6g湿树脂放于离子交换柱内，L-色氨酸溶液浓度为6g·L-1，以不同流速泵入离子交换柱，直到柱底流出液与上柱液浓度相同时停止上柱。根据结果分析，可以确定随着进料流速的增加，饱和吸附容量持续降低，但是为避免流速过慢造成吸附周期延长，应将进料速度控制在1ml·min-1。

3.3.2 洗脱速度

选择2mol·L-1氨水作为洗脱剂，按照0.5、1和2mol·L-1洗脱速度对吸附饱和树脂进行洗脱。试验结果证明随着洗脱速度的减低，洗脱效果越好。但是洗脱速度也不得过慢，避免延长洗脱周期，导致结柱现象严重，最佳洗脱速度应控制在0.5ml·min-1即可。

4 结束语

L-色氨酸对人和动物生命活动具有重要意义，为提高其收率，需要加深对发酵液分离纯化工艺的研究，掌握各项影响因素，对工艺过程进行有效控制，提高生产效率。

[1] 贺希娜.发酵液中L-色氨酸的分离纯化研究[D].福建师范大学，2013.

[2] 苏毅.发酵法生产L-色氨酸工艺优化[D].天津科技大学，2014.