石墨烯-壳聚糖复合材料修饰电极检测己烯雌酚

黄生权, 付 萌, 张 洁, 李文治, 张 芹, 邵科峰, 赵 波,*

(1.无限极(中国)有限公司,广东广州 510030;2.南京师范大学化学与材料科学学院,江苏南京 210023)



石墨烯-壳聚糖复合材料修饰电极检测己烯雌酚

黄生权1, 付 萌1, 张 洁2, 李文治1, 张 芹2, 邵科峰2, 赵 波2,*

(1.无限极(中国)有限公司,广东广州 510030;2.南京师范大学化学与材料科学学院,江苏南京 210023)

摘 要:制备了石墨烯-壳聚糖复合材料修饰电极,采用循环伏安法研究复合材料对电极导电性能的影响,并利用己烯雌酚抗体与己烯雌酚之间的特异性反应,以K3Fe(CN)6为探针,采用差分脉冲伏安法进行食品中己烯雌酚残留量的检测研究。在优化条件下,ρ(己烯雌酚)在1～2 500 μg/L内与电流差值呈线性关系,线性回归方程ΔI=25.036 8+0.003 42ρ(R=0.991 24),检出限为0.1 μg/L。对猪肉、牛肉、鸭肉及奶粉样品进行加标检测,回收率93.2%～106.8%。

关键词:己烯雌酚;石墨烯;壳聚糖;差分脉冲伏安法

HUANG Shengquan,FU Meng,ZHANG Jie,et al.Electrochemical immunosensor for diethylstilbestrol determination based on graphene-chitosan composite modified glassy carbon electrode[J].Journal of Food Science and Technology,2016,34(1):66-71.

*赵 波,男,教授,博士,主要从事食品安全检测与预警方面的研究。通信作者。

己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)是一种人工合成的1,2-二苯乙烯类物质,结构式见图1,具有促进动物生长、提高饲料转化率和减少脂肪合成等作用,曾被获准用作动物促生长剂,在20世纪六七十年代广泛用于动物养殖业[1]。己烯雌酚可通过食物链进入人体,产生激素分泌异常、乳腺癌和胚胎畸形等严重后果,因此在我国和欧美等国家和地区已被明令禁止用于动物养殖[2]。

图1　己烯雌酚结构式Fig.1 Structure of diethylstilbestrol(DES)

目前用于DES残留检测的方法主要有酶联免疫法[3-4]、色谱-质谱联用法[5-8]、高效液相色谱法[9-11]等。但这些方法都具有前处理复杂,价格昂贵以及携带不方便等缺点。

石墨烯材料由于具有超高的比表面积[12]和优异的电子传导能力[13]等优点,常用于制备高性能的纳米复合材料[14-17]。壳聚糖是一种含有大量羟基和氨基的天然高分子聚合物,对许多离子、生物大分子、有机物小分子都具有较强的吸附能力,并且价廉无毒,还有很好的渗透性和成膜性[18-19],被广泛用于各种传感器的制备[20-22]。石墨烯-壳聚糖复合物因同时具有良好的导电性和成膜性,常被用于电极的修饰,在食品和环境污染物的分析检测中得到了广泛应用[23-25]。

本文将纳米技术和免疫分析方法有机结合,构建了一种基于石墨烯-壳聚糖-己烯雌酚复合物修饰电极的免疫传感器,具有高灵敏、高选择性、低成本等优点,并将其运用于实际样品中己烯雌酚的检测。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器设备

壳聚糖和己烯雌酚,Sigma-Aldrich公司；己烯雌酚抗体,北京勤邦生物技术有限公司；牛血清白蛋白(BSA),上海慧颖生物科技有限公司。

磷酸缓冲溶液(PBS,pH值7.4)由0.1 mol/L 的KH2PO4和Na2HPO4按一定比例配制得到；提取液由乙腈与丙酮以体积比4：1的比例混合得到。其他试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

CHI-660D型电化学工作站,上海辰华仪器有限公司。

1.2 石墨烯-壳聚糖分散液的制备

1.2.1 氧化石墨的制备

将6 g石墨粉缓慢地加入到25 mL浓H2SO4、5 g K2S2O8与5 g P2O5的混合物中,室温反应过夜。将上述混合物在冰水浴冷却下加入到250 mL冷的浓H2SO4中,在搅拌下缓慢加入30 g KMnO4,并将温度控制在20℃以下。搅拌反应3 h后缓慢加入500 mL蒸馏水,保持温度在50℃以下,再搅拌反应2 h。然后加入25 mL浓H2O2溶液和1.5 L水,再搅拌反应24 h。离心分离,将产物依次用2.5 L的HCl溶液(3 mol/L)和2.5 L水洗至洗液呈中性。

1.2.2 石墨烯的制备

将0.1 g新制备的氧化石墨加入到200 mL的NaOH溶液(1 mmol/L)中,超声分散90 min；在4000 r/min下离心3 min,除去下层沉淀物后向上清液中加入0.2 mL水合肼,加热至90℃反应2 h,得到石墨烯分散液。

1.2.3 石墨烯-壳聚糖分散液的制备

将1.0 g壳聚糖加入到500 mL的HCl溶液(0.05 mol/L)中,搅拌并加热至90℃使其完全溶解,待冷却后用NaOH溶液(0.1 mol/L)将pH值调节至7,并用蒸馏水定容到1 L。取5.0 mg新制备的石墨烯加入到2 mL壳聚糖溶液中,超声分散1 h,得到石墨烯-壳聚糖分散液。

1.3 修饰电极的制备

将φ=3 mm的玻碳电极(glassy carbon electrode,GCE)用Al2O3抛光粉(φ=0.3 μm)抛光至镜面,用蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水依次超声清洗3 min,最后用蒸馏水冲洗干净,置于室温下晾干待用。将2 μL己烯雌酚溶液(质量浓度为0.2 g/L)与4 μL石墨烯-壳聚糖分散液混合均匀,滴涂于玻碳电极表面,置于37℃下烘干30 min。最后将电极置于牛血清白蛋白溶液(ω=5%)中浸泡30 min,用以封闭剩余的活性位点。

1.4 样品前处理

1.4.1 猪肉、牛肉及鸭肉样品的前处理

将(1±0.005)g猪肉、牛肉及鸭肉样品绞碎后分别置于10 mL的样品管中,加入己烯雌酚标准溶液,和3 mL乙腈-丙酮提取液(V(乙腈)：V(丙酮) =4：1),超声分散30 min。在2000 r/mim下离心10 min,吸取上清液,于50℃下氮气吹干,加入1 mL的磷酸缓冲溶液(pH值=7.4),溶解后用于电化学测试。

1.4.2 奶粉样品的前处理

将0.300 g奶粉置于10 mL的样品管中,加入己烯雌酚标准溶液和2 mL正己烷,超声分散30 min。在2 000 r/min下离心10 min,吸取上清液,于50℃下氮气吹干,加入1 mL的磷酸缓冲溶液(pH值= 7.4),溶解后用于电化学测试。

1.5 电化学测试

利用循环伏安法(cyclic voltammetry,CV)和差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)研究了修饰电极的电化学行为和优化的工作条件,并在优化实验条件下进行了实际样品中加标己烯雌酚含量的测定。其中,CV扫描电位为-0.2～0.8 V,扫描速率为100 mV/s；DPV扫描电位在-0.2～0.5 V,脉冲幅度为50 mV,脉冲宽度为50 ms。

所有电化学实验均采用三电极系统在CHI-660D电化学工作站上完成。其中工作电极为石墨烯-壳聚糖-己烯雌酚修饰的玻碳电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂丝电极。所有电化学测试均在K3Fe(CN)6的磷酸缓冲溶液中(pH值= 7.4)于室温下进行。

2 结果与分析

2.1 检测原理

采用己烯雌酚抗体与己烯雌酚的特异性结合反应的竞争模式实现对样品中己烯雌酚含量的检测,其工作原理如图2。1)当待测样品溶液中含有游离己烯雌酚时,修饰在电极上的己烯雌酚和游离己烯雌酚与样品溶液中加入的己烯雌酚抗体发生竞争反应,生成己烯雌酚-抗体复合物,从而使己烯雌酚抗体被吸附到电极上；2)电极表面形成的己烯雌酚-抗体复合物阻碍K3Fe(CN)6离子到达电极表面,导致电流下降；3)待测样品溶液中含有的己烯雌酚浓度不同,对电极电化学信号的影响即有差异,以此建立电化学信号与己烯雌酚浓度的响应关系,实现对样品溶液中己烯雌酚的检测。

2.2 修饰电极的循环伏安分析

采用循环伏安法对不同修饰电极的电化学行为进行了研究,其结果如图3。图3中曲线a为裸电极在K3Fe(CN)6溶液(2 mmol/L)中的CV曲线,其氧化峰电流值为24.9 μA；曲线b为石墨烯-壳聚糖-己烯雌酚修饰电极在K3Fe(CN)6溶液中的CV曲线,其氧化峰电流由24.9 μA增大到44.8 μA,表明电子传递作用得到了增强,这是由于石墨烯具有优异的导电性；曲线c为将以上修饰电极置于含有己烯雌酚抗体的孵育液中孵育后,再放入K3Fe(CN)6溶液中进行电化学扫描所得的CV曲线。其氧化峰电流下降为28.2 μA,这说明电子传递受到了一定程度的阻碍,这是由于己烯雌酚抗体与电极上修饰的己烯雌酚结合,形成己烯雌酚-抗体复合物,增加了对电子传递的阻碍,也说明己烯雌酚分子已有效地修饰到了电极上。

图2　己烯雌酚电化学免疫传感器的检测原理Fig.2 Principle of electrochemical immunosensor for DES detection

图3　电极在2 mmol/L的K3Fe(CN)6的PBS溶液中的CV曲线Fig.3 CV recorded in PBS solution containing 2 mmol/L K3Fe(CN)6

2.3 实验条件优化

采用差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)对检测条件的影响进行了研究,包括孵育时间和抗体使用量。扫描电位在0.2～0.5 V,脉冲幅度为50 mV,脉冲宽度为50 ms。

2.3.1 免疫反应时间

首先将使用的抗体体积固定在20 μL,对免疫反应时间进行了优化,结果如图4。

图4　孵育时间对DPV峰电流的影响Fig.4 Influences of incubation time on DPV response

由图4可知,DPV峰电流在0～5 min内迅速下降,在5～15 min继续下降,但趋于平缓,15～20 min反而有所增加,因此选择15 min作为免疫反应的孵育时间。

2.3.2 抗体使用量

在实验确定的优化孵育时间(15 min)下,对所用己烯雌酚抗体的体积进行了优化,结果如图5。

图5　抗体使用量的影响Fig.5 Influences of antibody volume on DPV response

由图5可知,DPV峰电流在抗体用量为1 μL时即发生较大程度变化(降低约30%),在抗体用量为1～10 μL时继续下降,但趋势放缓(降低约22%),超过10 μL之后电流基本不再降低,说明抗体已基本和电极上修饰的己烯雌酚完全结合,因此选择10 μL作为免疫反应中使用的抗体量。

2.4 己烯雌酚的检测

将修饰电极放在含有10 μL抗体的磷酸缓冲溶液中孵育后的DPV峰电流定义为I0,在含有己烯雌酚和相同浓度抗体的缓冲溶液中孵育后的DPV峰电流定义为Ix,则电流的增加值ΔI=Ix-I0。在上述实验确定的优化条件下,测定了修饰电极在缓冲溶液和含有不同浓度的己烯雌酚和相同浓度己烯雌酚抗体的孵育液中孵育后,在2 mmol/L的K3Fe(CN)6的PBS溶液中的DPV曲线,见图6(图6中曲线a为空白缓冲溶液,曲线b～h分别为含有相同浓度的己烯雌酚抗体和己烯雌酚浓度依次为2 500 μg/L,1 500 μg/L,1 000 μg/L,500 μg/L,100 μg/L,1 μg/L和0的孵育液)。

图6　修饰电极在缓冲溶液和含有相同浓度的己烯雌酚抗体与不同浓度的己烯雌酚中的DPV曲线Fig.6 DPV curves of modified immunosensor after incubating with blank solution and various concentrations of DES combined with same concentration of DES antibody in buffer solution

当溶液中游离己烯雌酚浓度逐渐增加时,抗体与游离己烯雌酚结合的部分随之增加,而与电极上修饰的己烯雌酚结合的部分相应减少,对电极导电能力的阻碍随之减小,因此DPV峰电流的增加值ΔI逐渐增大。结果表明,ΔI与溶液中己烯雌酚密度在1～2 500 μg/L范围内呈良好的线性关系,线性回归方程为ΔI=25.036 8+0.003 42ρ,R=0.991 24,式中ΔI,μA；ρ,μg/L,最低检测限为0.1 μg/L。

2.5 免疫传感器的重复性、稳定性与再生

对石墨烯-壳聚糖-己烯雌酚修饰电极重复进行10次DPV扫描,峰电流值变化小于5%,说明本实验具有较好的可重复性。将2支修饰电极分别存放在磷酸缓冲溶液(pH值=7.4)和空气中,每天进行DPV扫描,峰电流值在5 d内降低值不超过10%,说明制备的修饰电极具有较好的稳定性。

将孵育过的修饰电极置于0.1 mol/L的甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH值=2.8)中浸泡20 min,可以洗去吸附在电极表面的己烯雌酚抗体。

2.6 实际样品的分析

对猪肉、牛肉、鸭肉及奶粉4种实际样品以实验步骤1.4中所述方法进行前处理,然后用优化的实验条件进行测定,每个添加浓度测定3次,统计结果见表1。

表1　样品加标处理测试己烯雌酚实验结果Tab.1 Recoveries of diethylstilbestrol from spiked samples

从表1中可以看出,猪肉样品中添加己烯雌酚的回收率在93.2%～98.5%,鸭肉样品添加己烯雌酚的回收率在99.0%～106.6%,牛肉样品的回收率在86.1%～105.4%,牛奶样品的回收率在100.6%～106.8%。

3 结 论

本文构建了一种基于石墨烯-壳聚糖-己烯雌酚修饰电极的电化学免疫传感器,结合了石墨烯高比表面积、高导电性能,以及壳聚糖的优良成膜性能。采用竞争法检测己烯雌酚时,线性范围为1～2 500 μg/L,检测限为0.1 μg/L,完全能满足国家对于雌酚类兽药残留规定的检测要求[2]。将此免疫传感器用于猪肉、鸭肉、牛肉及奶粉实际样品中己烯雌酚的检测,回收率在93.2%～106.8%。

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(责任编辑:李 宁)

Electrochemical Immunosensor for Diethylstilbestrol Determination Based on Graphene-Chitosan Composite Modified Glassy Carbon Electrode

HUANG Shengquan1, FU Meng1, ZHANG Jie2, LI Wenzhi1, ZHANG Qin2, SHAO Kefeng2, ZHAO Bo2,*
(1.Infinitus(China)Co Ltd,Guangzhou 510030,China；2.School of Chemistry and Materials Science,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China)

Abstract:A graphene-chitosan modified glassy carbon electrode was prepared.Electrical conductivity of the modified glassy carbon electrode(GCE)was investigated by cyclic voltammetry(CV).Competitiveelectrochemical immunoassay was performed to detect diethylstilbestrol by differential pulse voltammetry (DPV).Under the optimized conditions,the Δ-value of oxidation peak current was proportional to diethylstilbestrol concentration in the range between 1 and 2 500 μg/L.The linear equation was ΔI= 25.036 8+0.003 42ρ(R=0.991 24),and the detection limit was 0.1 μg/L.A good recovery of diethylstilbestrol in the range of 93.2%-106.8%was obtained in pork,beef,duck,and milk powder.

Key words:diethylstilbestrol；graphene；chitosan；differential pulse voltammetry

作者简介:黄生权,男,博士后,主要从事食品加工技术与应用方面的研究；

基金项目:江苏省科技支撑计划项目-社会发展(BE2014720)；江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(14)2127)。

收稿日期:2015-01-01

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2016.01.010

文章编号:2095-6002(2016)01-0066-06

中图分类号:TS207.3

文献标志码:A

引用格式:黄生权,付萌,张洁,等.石墨烯-壳聚糖复合材料修饰电极检测己烯雌酚[J].食品科学技术学报,2016,34(1):66-71.