生物技术在林木遗传育种中的应用

李联队，季志平，何佳林

(1.陕西省森林保护研究所，陕西 西安 710082；2.西北农林科技大学,陕西 杨凌 712100)

生物技术在林木遗传育种中的应用

李联队1，季志平2*，何佳林2

(1.陕西省森林保护研究所，陕西 西安 710082；2.西北农林科技大学,陕西 杨凌 712100)

随着经济增速的加快和工业化进程的推进，社会总体对林木数量及种类的需求也越来越多，给林木遗传育种提出了更高的要求。生物技术在此需求下逐渐应用于林木育种，并起到了重要推动作用。本文从分子标记、辐射育种、基因工程、细胞工程等四个方面，对生物技术在林木遗传育种中的应用进行了综述分析，希望对林木业的发展有着极大的推动作用，并为我国林业可持续健康发展提供参考。

林木；生物技术育种；分子标记；基因工程；细胞工程

林木遗传育种是林木遗传改良中最为重要的任务之一。主要是以林木遗传变异规律及林木育种理论为指导，结合现有生物技术，使林木在抗性、矮干、熟期、高产、品质等许多性状方面得到改进，进而提高木材的选育水平[1-4]。

近年来，随着生物技术的革新，人们利用分子生物学和细胞生物学技术从物种起源、基因标记及多样性鉴定等方面对林木品种选育做了很多研究，同时也取得了很好的进展。对于我国林木遗传育种而言，起步较晚，基本是从新中国成立尤其是改革开放以后才慢慢得以开展，且发展迅猛、成效显著。我国林木育种发展是从20世纪60年代第一个种子园建立开始的，随后国家将林木遗传育种纳入了国家科技公关计划，并开展了一系列的良种选育、种子园建设，以及濒危珍稀树种调查与保存等工作。通过努力，国家林木育种种质库收集了大量优树种质，并保存了3000余份无性系。与此同时，在林木引种方面，成功引进了国外的杨树、桉树、松树、相思树等优良用材，共建千余处良种示范基地，并在研究美洲黑杨、欧美杨的三元交配作图策略方面取得了突破性进展，获得了近1000个分子标记[5]。另外，在林木转基因(如欧洲黑杨转Bt基因)、优良无性系组织培养、工厂化育苗及分子辅助选择育种方面也取得了较大的进展。

1 分子标记技术

DNA分子标记技术是基于核苷酸序列的差异，结合PCR技术直接反映DNA水平遗传多态性，较传统的形态标记、生化标记等更精确、稳定，信息量大。

1.1 分子标记技术种类

自DNA限制性片段多态性(RFLP)标记技术建立以来，随着生物技术的迅猛发展，DNA分子标记技术也得到了不断的改进和提高，并日趋成熟。就目前比较广泛应用于林木遗传育种中的分子标记技术而言，除限制性片段多态性(RFLP)技术以外，主要还有随机扩增多态性(RAPD)标记技术、扩增片段长度多态性(AFLP)标记技术、简单重复序列(SSR)标记技术以及简单重复序列间扩增(ISSR)标记技术等，这些技术已广泛应用于林木多样性分析、遗传图谱构建、品种及纯度鉴定、杂交种培育等多个方面。此外，新发展起来的第三代分子标记单核苷酸多态性标记技术(SNP)，不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记，革新后的技术具备了第一、二代分子标记技术不具备的优点，即高密度、遗传稳定性、双等位型、易实现自动化等。因此，在林木遗传育种、高密度林木遗传图谱构建、种群遗传学、系统进化等方面具有广阔的应用前景[6]。但是，目前SNP检测技术仍然不够成熟，无法实现遗传信息数据的有效分析，缺乏数据库支撑，致使该技术仍处于探索阶段。

1.2 分子标记技术的应用

传统物种亲缘关系的划分和鉴定主要侧重于物种宏观形态的分析，这种划分结果很容易受主观或客观条件的影响，从而不能准确的进行分类和鉴定。然而，在林木遗传分类、鉴定过程中，往往受某些优势种属自身基因的遗传漂变、迁徙、变异和选择的影响，导致不同群落类中物种遗传多样性的显著变化，经过长期积累，最终致使某些功能器官或组织产生较大差异，因此，简单的从形态学角度分析是不能满足分类或鉴定的要求，就有必要对其进行深入的研究与分析，以利于保护与利用。研究表明，物种的外在表现必然是基于其自身基因的表达，所以遗传多样性分析可以根据体现其差异的同源序列的差别作进一步的划分。如：姜景民等利用RAPD方法，合成119条随机引物，对木兰科含笑属乐昌含笑(Micheliachapensis)6个种群的遗传多样性及分化程度进行了分析，扩增出了111个可分析位点，结果表明：与多数植物相比较，乐昌含笑具有较高的遗传多样性，群体内的遗传多样性大于种群间的遗传变异[7]。张军丽等利用AFLP技术分析了南亚热带阔叶林优势种黄果厚壳桂在三个不同生境三个种群的遗传多样性，结果表明黄果厚壳桂(Cryptocaryaconcinna)种群内遗传多态性高、种群间遗传分化低，不同生境在一定条件下对种群的遗传结构及遗传多样性产生影响[8]。另外，王峥峰等借助AFLP研究方法，以鼎湖山锥栗(Castaneahenryi)3个种群为研究对象分析种内和种间的遗传分化特征，结果表明锥栗不同亚种群有不同的遗传多样性，这正是种群本身遗传特征的体现，并与群落演替密切相关，一定程度也揭示了不同群落微环境对种群遗传的影响[9]。王佳媛等利用SNP标记技术对嘛咪泽和美姑大风顶两个自然保护区内凹叶木兰(Magnoliasargentiana)不同种群遗传多样性进行了初步研究，结果表明这两个自然保护区内凹叶木兰具有较高的遗传多样性，进而为这两个保护区内野生凹叶木兰的保护政策的制定提供了科学的理论依据。欧阳磊等以国家级杉木(Cunninghamialanceolata)种质资源库中保存的遗传材料为对象，利用52对SSR引物分析了这些遗传材料的遗传多样性，为种质资源管理和提升育种效率提供了指导性依据[10]。李卫星等采用ISSR分子标记技术分析了42个银杏(Ginkgobiloba)雄株的亲缘关系，结果表明银杏雄株间的亲缘关系与生长地区分布不完全相关。在林木遗传改良中，通过分子标记技术对遗传进化关系进行分析，在分子水平上阐明生物系统进化关系，有利于育种亲本的选配和种质资源的合理利用[11]。

2 细胞工程技术

细胞工程是以改变细胞遗传物质为基础，运用无菌操作方法培养出大量的细胞、组织直至整个个体的一项生物技术。该技术在林木育种中的应用主要集中在人工种子、细胞杂交、体细胞胚胎发生、植株再生、原生质体培养等方面，且取得了相当大的进展。

2.1 胚状体产生与人工种子

体细胞胚胎发生是指单倍或双倍体细胞或单个花粉在特定条件下未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径(通过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷型胚期和子叶期)，发育成新个体的过程，这种类合子胚结构称为胚状体或体细胞胚。研究表明，体细胞胚具有较高的繁殖效率和再生能力，且后代也具有极好的稳定性，所以在生物细胞研究过程中往往将其作为转基因或人工种子的绝佳材料。随着生物技术应用范围的拓宽，目前该技术已被广泛应用于林木遗传育种，如马尾松(Pinusmassoninana)、红豆杉(Taxuschinensis)、华山松(Pinusarmandicv.amamina)、杂种鹅掌揪(Liriodendronchinense×L.tulipfera)等木本植物已获得了体细胞胚，且部分已通过体细胞胚的再发生而获得了再生植株。随后，以减少或避免现有林木种子缺点为目标，利用体细胞胚发生技术研究并开发了人工种子，主要集中应用在固定杂种优势、缩短育种周期、降低成本等方面，如：柑桔、合欢、云杉、松树、山茶等林木都已成功生产出人工种子[12]。

2.2 体细胞无性系变异与突变体筛选

体细胞无性系是指植物细胞、组织或器官在无菌条件下进行离体人工培养，经脱分化和再分化过程，重新形成愈伤组织和完整植株。该技术最大的优点就是繁殖系数高，可规模化批量培养植物个体，但是植物离体培养细胞在发育成植株的过程中，容易受外界环境干扰，进而发生变异。相对于自然界中体细胞变异而言，此类体细胞变异的频率及概率相对较高，易获得新生植株。将其应用于林业生产发现，该技术能在很大程度上促进植物变异，进而提升了获得新型优良树种的概率。

2.3 原生质体培养与细胞融合

林木遗传育种主要受生育期长和基因杂合等因素影响，使得传统的林木遗传育种受到很大的限制。20世纪80年代初，林木原生质体研究慢慢得到了发展。该技术受到重视的原因是在于单个细胞在去掉细胞壁时仍然是一个活体，仍具有细胞的全能性，可以培养成为原生质体植株。另外，由于没有细胞壁障碍，原生质体不仅可以摄入外源细胞器并分离出遗传物质，还可以与异源原生质体融合，从而形成体细胞杂种。这种杂种是永远都不可能被人工杂交和自然杂交所实现，因为在进化的过程中，植物已经形成了严格的生殖隔离。但是，原生质体融合技术就能很好地克服生殖隔离问题，进而实现异源体细胞融合，并最终将其诱导成为完整植株，丰富物种系统[13]。此项类研究在林木育种应用实践上已取得了一定的成效，如加勒比松(P.caribaea)、小叶杨(Populussimonii)等植物利用原生质体培养技术，获得了再生植株；杨柳属杂种(Populus)和山茄(Hibiscussabdcuiffa\%)进行原生质体融合，也获得了再生植株形态与杨树类似的植株。

3 辐射育种技术

3.1 辐射育种的应用现状

辐射育种即人工利用各种物理诱变因子，刺激诱发植物产生稳定遗传变异的方法。该技术可以获得有利用价值的突变体，进而有效的提高林木育种速度。辐射育种可以促使植株发生变异，且突变率远远高于自然变异率100～1000倍[14]。另外，该技术又以其安全、简便、能打破旧的性状连锁、短时间内可选育新品种等特点而成为改良植物品种的新方法、新技术。该技术始于20世纪30年代，历经数十年的研究与发展，在诱变手段、辐射剂量以及辐射生物学效应等方面取得了长足进步，且已广泛应用于新品种的选育，诱变体系也日臻完善。近年来，我国利用辐射育种技术在林木遗传育种方面取得了较优异的成果，主要树种有杉木、毛白杨、榆树和松树等。

林惠斌等用γ和中子射线处理毛白杨和毛新杨的杂种种子30235粒，并从中筛选出了543个无性系，且苗期对比试验表明，小于半致死剂量辐射下，辐射的苗木入选率高达8.3%，比不辐射的高出1倍，并且能促进苗木的分化；辐射处理过的种子和花粉的受精率、入选率都会有很大的提高[15]。王孜昌等利用60Coγ射线分别处理杉树的干种子和湿种子，结果表明不同种子对辐射承受能力表现出较大的差异，干种子的最佳辐射剂量为5000R(136. 6R/min)，湿种子的最佳辐射剂量为500R(136. 6R/min)，二者的差率约为10倍[16]。张兴等利用60Coγ射线照射榆树种子，结果表明榆树种子对辐射的半致死剂量为50Gy，并筛选出了5种类型的突变体，同时还观察了射线对生长点和叶型的影响[17]。康向阳等利用不同辐射强度的60Coγ射线照射白杨二倍性未减数花粉和单倍性花粉，并对其萌发过程进行观察和统计，结果表明：二倍性花粉对60Coγ的敏感程度是单倍性花粉的2倍。因此可借助这一结果利用射线处理花粉粒以刺激二倍性花粉萌发，同时杀死或抑制部分单倍性花粉，从而提高二倍性花粉的萌发比例，最终达到克服二倍性花粉在参与受精过程中萌发迟缓的问题[18]。此外，也可用特定强度的60Coγ射线照射松树花粉粒，在不破坏蛋白质、氨基酸、微量元素的情况下，完成对松树花粉的消毒灭菌。

3.2 辐射育种的应用前景

从辐射育种的作用可以看出，辐射育种既可以创制出新的种质材料，又可以避免树种的安全隐患。就国内目前林木遗传育种工作而言，林木品种的栽植日趋单一，以至于导致用于新品种选育的种质资源逐步匮乏[19]。针对此类问题，辐射诱变技术可以充分发挥自身优势，创制出各种类型新的林木品系和种质，以弥补种质资源匮乏。另外，借助辐射源诱导林木发生突变，改变林木的遗传性状，从而创制出各具特色的新种质、新材料。林木辐射诱变可产生大量的突变类型，但仅需利用无性生殖的方式固定少量有益突变即可，从而解决林木遗传中的某些特殊问题。在林木育种中，诱变育种和常规育种二者是相辅相成、相互补充的关系。诱变育种既可以弥补传统育种的不足，也是对林木传统育种的发展和优化，此二者均在林木遗传改良工作中占有重要的地位。单一的林木辐射诱变存在明显突变频率不高的问题，但解决这一问题的关键方法就是协同离体培养技术，既可以充分提高后代的变异频率，又可以显著的缩短育种年限。除此之外，也可将辐射诱变同基因工程技术结合，从而既可以增加外援基因的转导频率也可以增加外源基因选择效率。如将辐射育种同航天育种相结合，可显著的提高基因突变频率与突变类型[20]。辐射育种与分子标记技术相结合，可以准确的把表型与基因位点联系起来，从而区分真假突变体，使一些表型没有明显变化的突变体在短时间内准确的被检测出来，从而提高突变体的选择效率。随着林木遗传育种研究的持续深入，辐射育种技术在林木种质资源开发，新品系改良或选育方面已占有重要的地位。如将辐射育种与航天育种、分子标记等技术相结合并运用于林木遗传改良，这将对我国乃至世界的林木遗传育种的发展具有重要的实践意义。

4 基因工程技术

4.1 抗逆性相关基因工程

随着生物技术的迅速发展，转基因技术也逐渐渗入林木遗传育种领域，为林木遗传改良提供了可靠的途径。林木遗传基因图谱的构建及数量性状基因的定位标志着林木遗传改良研究取得了很大的成就。目前，基因图谱在林木遗传改良中得到了广泛应用，并在多个国家取得了很大成效，主要应用于松树、杨树、桉树等林木的抗性研究中。林木业在发展过程中，总会伴随有虫害，而且虫害严重制约着林木业的发展。因此，借助基因工程技术加强林木抗虫基因的转导效率，如将苏云金杆菌的肉毒素基因有效的转入林木细胞，从而获得转基因植株，进而有效的提高植株的抗虫性。将水稻的半胱氨酸蛋白酶抑制因子OCI基因转入杨树植株中，可显著提高杨树对病虫害的抗性[21]。另外，在抗性研究方面，除了抗虫特性以外还获得几十个其他抗逆相关的基因，如李园园等将柽柳的转录因子TabZIP基因转入白桦基因组中，结果表明该转录因子的转入可提高白桦植株耐盐能力。张瑞萍等从柽柳cDNA中克隆得到ThDHN序列，并转入白桦，结果表明转基因植株表现出较好的耐盐性和抗旱性[22]。

4.2 材质相关基因

目前，利用基因工程技术在林木中扩增并获得了多个与木材品质相关的基因，如4CL、CAD、C3H、MYB、CCR、COMT、CCoAOMT等[23]，这些基因的表达均与木质素和纤维素的合成相关，如：吕梦燕等构建了东北白桦COMT1植物过量表达及反义表达载体，并遗传转化得到11个东北白桦转反义COMT1基因株系，还发现COMT1基因明显降低的植株中木质素合成代谢途径受到很大的干扰[24]。贾彩虹等通过抑制毛白杨株系4CL基因表达可显著降低该植株的木质素含量[25]。

4.3 生殖相关基因

林木一般生长周期较长，很大程度限制了育种进程，可以利用基因工程技术改变林木的生长发育周期，从而促进其提前开花，达到缩短育种周期的目的，如野生杨树一般开花需要8～20a，而转LFY基因的杨树仅需要5个月就可以开花[23]。另有研究表明，AP1是一个促进花芽分化和花器官形成的关键基因，东北农业大学将该基因转入白桦植株中，结果发现该基因可促使白桦植株提前开花[26]。在雌蕊发育方面，魏继承等依据欧洲白桦植株已发表的序列数据库，克隆并获得了BpMADS1，BpMADS3，BpMADS5和BpSPL1等基因，通过进一步试验研究又发现了一个BpSPL2基因，结果表明该基因的表达仅在胚珠发育时上升，说明该基因很大程度上与白桦雌花序的发育有很大影响[27]。在雄花发育方面，刘瀛等利用cDNA-AFLP方法在白桦扩增并获得了与雄花发育相关的30多个转录因子，初步推断其中部分转录因子在雄花发育早期起关键性作用[28]。

5 结语

综上所述，随着科学技术的发展，生物技术也取得了长足的进步，并广泛应用于各个领域中，尤其是在林木遗传改良中表现的尤为突出，对促进林木行业发展有着一定的推动作用。传统的林业育种需要依靠科技技术进行改革，从而节省人力、物力，实现常规育种所达不到的效益。本文主要从分子标记技术、细胞工程技术、辐射育种技术、基因工程技术等方面对林木遗传育种现状进行了简要的分析，希望通过本文的阐述，对促进生物技术在林木遗传改良中的应用起到推动作用。

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Bio-techniques Application to the Genetic Breeding of Forest Trees

LILian-dui1,JIZhi-ping2*,HEJia-lin2

(1. Shaanxi Forest Protection Institute, Xi’an, Shaanxi 710082;2.Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100)

Withtherisingoflivingstandardofpeopleaswellasthesocial-economicdevelopment,thedemandsforforestintermsofscaleandtypesareincreasing,whichinturnposesgreatrequirementforgeneticbreedingofforesttrees.Thepaperdescribedthegeneticbreedingoftreesbybio-techniquesregardingmolecularmarker,radiationbreeding,geneticengineeringandcellengineering,hopingpositiveimprovementfortheforestrydevelopment.

Foresttrees;bio-techniquesforbreeding;molecularmarker;geneticengineering;cellengineering

2016-09-10 基金项目：国家林业局林业科学技术推广项目([2016]45号)。

李联队(1970-)，男，陕西兴平人，本科，主要从事经济植物利用与保护研究。

Q

A