鱼腥草内生放线菌F03培养条件的优化及抑菌活性物质的初步研究

于　哲，张　爽

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 712000)



鱼腥草内生放线菌F03培养条件的优化及抑菌活性物质的初步研究

于哲，张爽

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 712000)

摘要：F03是分离于秦岭野生鱼腥草根部的一株抗菌活性较强的内生放线菌。以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用单因素实验和正交实验对鱼腥草内生放线菌F03培养基的碳源、氮源和发酵条件进行优化，并对发酵液抑菌活性物质进行初步研究。优化后的最佳培养基为：葡萄糖30 g，蔗糖10 g，黄豆粉10 g，蛋白胨10 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 1 g，CaCO3 2 g，蒸馏水1 000 mL；最优发酵条件为：发酵液初始pH值8，发酵时间7 d，发酵温度28 ℃，摇床转速140 r·min-1，接种量7%；抑菌活性物质的热稳定性和酸碱稳定性好；Doskochilova溶剂系统纸层析测定结果表明，该发酵液中对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性的物质为水溶性抗生素。

关键词：内生放线菌；最佳培养基；发酵条件；优化；鱼腥草；抑菌活性物质

植物内生菌因能产生与宿主植物相似或活性更强、结构更新颖的代谢产物而成为近年来的研究热点。目前使用的抗生素大部分来自放线菌的代谢产物，其中链霉菌属产生的抗生素种类最多[1-3]。植物内生放线菌作为一类特殊环境下的新型微生物资源，是植物微生态系统中最重要的组成部分，在防治疾病和减轻病害等方面具有独特优势。因此，从植物内生放线菌中寻找和开发具有抑菌活性的菌株和新型的生物制剂，对推动我国医药发展和农业生产具有重要的理论和现实意义。

鱼腥草为药食两用植物，具有清热解毒、消痈排脓、利湿通淋等功效，且对多种细菌、真菌均有较明显的抗菌作用[4]。近年来，鱼腥草内生菌受到研究者的广泛关注。胡汝晓等[5]研究了鱼腥草不同部位内生菌的分布情况，发现鱼腥草不同部位存在着大量的内生菌，开发潜力巨大。杨春平等[6]对鱼腥草内生放线菌进行分离并研究了其对不同植物病原菌的抑菌活性，发现有几株放线菌对多种病原菌都有很好的抑菌活性。研究表明，分离于秦岭野生鱼腥草根部的内生放线菌F03的发酵液对多种细菌、真菌均有很好的抑菌活性，特别是对金黄色葡萄球菌的抑菌效果尤为显著。

鉴于此，作者以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用单因素实验和正交实验对鱼腥草内生放线菌F03培养基的碳源、氮源和发酵条件进行优化，并对发酵液抑菌活性物质进行初步研究，旨在提高该菌株抑菌活性物质的产量，拟为后续抑菌活性物质的开发奠定基础。

1实验

1.1菌种与培养基

金黄色葡萄球菌、鱼腥草内生放线菌F03，陕西国际商贸学院医药学院微生物实验室。

LB培养基：蛋白胨10 g、酵母粉 10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

基础发酵培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、K2HPO40.3 g、NaCl 1 g、 CaCO32 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1种子液的制备

将培养5 d的鱼腥草内生放线菌F03用打孔器打成直径5 mm的菌饼，放入装有50 mL高氏一号发酵液的250 mL三角瓶中，每瓶放入3个菌饼。在30 ℃、摇床转速150 r·min-1、pH值为7的条件下培养5 d，即得种子液。

1.2.2发酵液的制备

按5%的接种量将培养好的种子液无菌操作下转接到装有100 mL基础发酵培养液的三角瓶中，在发酵液初始pH值为7、摇床转速为150 r·min-1、30 ℃下振荡培养9 d后，用布氏漏斗过滤，弃去菌体，即得发酵液。

1.2.3抑菌活性的测定

用直径4 mm的打孔器在涂有金黄色葡萄球菌的培养皿中打2个菌孔，用移液枪吸取50 μL发酵液于菌孔中，在28 ℃培养箱中培养48～96 h，测量抑菌圈直径。

1.2.4培养基碳源、氮源的筛选

(1)碳源的筛选

在基础发酵培养基的基础上，用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉作为培养基的碳源，其它成分保持不变。通过测量抑菌圈直径，筛选出最佳碳源。

(2)氮源的筛选

在基础发酵培养基的基础上，用黄豆粉、酵母粉、蛋白胨和(NH4)2SO4作为培养基的氮源，其它成分保持不变。通过测量抑菌圈直径，筛选出最佳氮源。

1.2.5最佳发酵条件的筛选

(1)发酵液初始pH值的筛选

在优化后的最佳培养基的基础上，将发酵液初始pH值分别调至5、6、7、8、9、10，在30 ℃、摇床转速150 r·min-1、接种量5%的条件下发酵培养9 d，得发酵液。测量发酵液的抑菌圈直径，筛选出最佳发酵液初始pH值。

(2)发酵时间的筛选

按5%的接种量将种子液接入100 mL发酵液中，在筛选出的最佳发酵液初始pH值的基础上，于30 ℃、摇床转速150 r·min-1的条件下分别发酵培养5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，得发酵液。测量发酵液的抑菌圈直径，筛选出最佳发酵时间。

(3)发酵温度的筛选

在筛选出的最佳发酵液初始pH值和发酵时间的基础上，将发酵液分别在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃下发酵培养，得发酵液。测量发酵液的抑菌圈直径，筛选出最佳发酵温度。

(4)摇床转速的筛选

在筛选出的最佳条件下，将发酵液放入转速分别为100 r·min-1、120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1的摇床内振荡培养，得发酵液。测量发酵液的抑菌圈直径，筛选出最佳摇床转速。

(5)接种量的筛选

在筛选出的最佳条件下，分别按3%、5%、7%、9%、11%的接种量将种子液接入发酵培养液中培养，得发酵液。测量发酵液的抑菌圈直径，筛选出最佳接种量。

1.2.6发酵液抑菌活性物质的研究

(1)抑菌活性物质热稳定性的测定

将发酵液在60 ℃和100 ℃下分别放置60 min、120 min、180 min、240 min后，用蒸馏水调体积至原始体积。用打孔法分别测量发酵液的抑菌圈直径，以未处理的发酵液为对照。

(2)抑菌活性物质酸碱稳定性的测定

将发酵液的pH值分别用1 mol·L-1HCl、1 mol·L-1NaOH调至1、3、5、7、9、11、13，静置30 min、60 min、90 min后，再分别调发酵液的pH值到7，用打孔法测量发酵液的抑菌圈直径，以未处理的发酵液为对照。

(3)发酵液Doskochilova溶剂系统纸层析

用移液枪取100 μL发酵液均匀点到距滤纸(10 cm×15 cm)边缘10 mm处，再放入装有展开剂的试管(12 mm×18 cm)中饱和20 min。将饱和的点样滤纸的一边浸没于展开剂中约5 mm，待展开剂扩展到滤纸约10 cm处取出，自然晾干。将晾干的滤纸放入铺有金黄色葡萄球菌的LB平板上，在28 ℃培养箱中培养48 h后，取出观察抑菌圈位置，记录Rf值。

2结果与讨论

2.1培养基碳源、氮源的筛选

2.1.1碳源的筛选(图1)

图1　碳源对发酵液抑菌活性的影响

从图1可看出，以葡萄糖作为碳源时，发酵液的抑菌活性最高，其次是蔗糖。说明，放线菌F03对葡萄糖和蔗糖的利用率高，更易合成活性产物。因此，选择葡萄糖和蔗糖作为碳源。

2.1.2氮源的筛选(图2)

从图2可看出，以黄豆粉和蛋白胨作为氮源时，发酵液的抑菌活性最高。可能是因为，黄豆粉中除了有微生物需要的氮源外，还有一些其它有利于放线菌活性物质合成的复杂化合物。因此，选择黄豆粉和蛋白胨作为氮源。

2.1.3碳源、氮源的正交实验

根据单因素实验筛选出的最佳碳源和氮源设计正交实验，正交实验的因素与水平见表1，正交实验结果见表2。

图2　氮源对发酵液抑菌活性的影响

表1正交实验的因素与水平/%

Tab.1　Factors and levels of orthogonal experiment/%

表2正交实验结果

Tab.2　Results of orthogonal experiment

从表2可看出，在7#的碳氮源配比下，发酵液的抑菌圈直径最大，即抑菌活性最高。因此，放线菌F03的最适培养基为葡萄糖30 g、蔗糖10 g、黄豆粉10 g、蛋白胨10 g、K2HPO40.3 g、NaCl 1 g、CaCO32 g、蒸馏水1 000 mL。

2.2发酵条件的筛选

2.2.1发酵液初始pH值的筛选(图3)

由图3可知，发酵液初始pH值对发酵液的抑菌活性影响显著。在酸性条件下不适合活性产物的合成，抑菌活性较低；在偏碱性条件下，抑菌活性较高，当发酵液初始pH值为8时，抑菌圈直径最大。因此，发酵液的最佳初始pH值为8。

图3　发酵液初始pH值对发酵液抑菌活性的影响

2.2.2发酵时间的筛选(图4)

图4　发酵时间对发酵液抑菌活性的影响

由图4可知，随着发酵时间的延长，活性代谢产物不断增多，发酵液的抑菌活性不断升高；到第7 d时，发酵液的抑菌活性达到最高；但随着发酵时间的继续延长，发酵液的抑菌活性呈下降趋势，即代谢产物的活性不断降低。因此，选择7 d为最佳发酵时间，不仅可以节约成本，还可以提高活性产物含量。

2.2.3发酵温度的筛选(图5)

图5　发酵温度对发酵液抑菌活性的影响

由图5可知，在24～32 ℃范围内，发酵液抑菌活性先升高后降低，在28 ℃时达到最高。因此，选择最佳发酵温度为28 ℃。

2.2.4摇床转速的筛选(图6)

图6　转速对发酵液抑菌活性的影响

由图6可知，摇床转速对发酵液的抑菌活性有一定的影响。在摇床转速为100 r·min-1时，发酵液的抑菌活性最低，可能是因为，微生物在合成活性代谢产物时需要大量氧气，若摇床转速太慢，所提供的氧气量较少，不利于合成活性产物。随着摇床转速的加快，抑菌活性升高，但摇床转速超过140 r·min-1后，继续加快转速，抑菌活性反而降低。因此，选择最佳摇床转速为140 r·min-1。

2.2.5接种量的筛选(图7)

图7　接种量对发酵液抑菌活性的影响

由图7可知，若接种量太少，发酵液的抑菌活性较低，这是由于，菌体太少，产生的活性物质相应较少；随着接种量的增加，抑菌活性先升高后降低，在7%时达到最高。这可能是由于，菌株量过多，大部分营养成分用于前期的菌体生长，以至于后期代谢产物的合成受到影响。因此，选择最佳接种量为7%。

2.3发酵液抑菌活性物质的研究

2.3.1抑菌活性物质的热稳定性(图8)

图8　抑菌活性物质的热稳定性

由图8可知，发酵液的抑菌活性物质在60 ℃和100 ℃下均比较稳定。虽然在100 ℃下放置一段时间后抑菌活性稍有下降，但总体来说，抑菌活性物质的热稳定性较好。

2.3.2抑菌活性物质的酸碱稳定性(图9)

图9　抑菌活性物质的酸碱稳定性

由图9可知，pH值对发酵液抑菌活性影响不大，发酵液的抑菌活性仅在pH值为1、3时稍低。因此，发酵液抑菌活性物质的酸碱稳定性较好。

2.3.3Doskochilova溶剂系统纸层析测定结果(图10)

由图10可看出，发酵液中抑菌活性成分在第5和第6溶剂系统，即正丁醇饱和的浓度为0.5 mol·L-1、pH值为7的磷酸缓冲液和正丁醇饱和的内含2%对甲基苯磺酸的水中的Rf值比较大，均在0.9左右。其它溶剂系统的Rf值都比较小，有的甚至为0。参照经典的抗生素纸色谱，初步推断发酵液中的抑菌活性成分是一种大极性的水溶性抗生素。

图10发酵液的Doskochilova溶剂系统的Rf值

Fig.10TheRfvalues of the fermentation broth in Doskochilova solvent system

3结论

通过单因素实验和正交实验确定了鱼腥草内生放线菌F03的最佳培养基为：葡萄糖30 g，蔗糖10 g，黄豆粉10 g，蛋白胨10 g，K2HPO40.3 g，NaCl 1 g，CaCO32 g，蒸馏水1 000 mL。最佳发酵条件为：发酵液初始pH值8，发酵时间7 d，发酵温度28 ℃，摇床转速140 r·min-1，接种量7%。发酵液抑菌活性物质的热稳定性和酸碱稳定性较好，发酵液中的抑菌活性成分是一种大极性的水溶性抗生素。

参考文献：

[1]姜怡,唐蜀昆,张玉琴,等.放线菌产生的生物活性物质[J].微生物学通报,2007,34(1):188-190.

[2]张华,姜成林,徐丽华,等.药用微生物资源[J].微生物学通报,2004,31(2):152-153.

[3]SANCHEZ S,DEMAIN A L.Metabolic regulation of fermentation processes[J].Enzyme & Microbial Technology,2002,31(7):895-906.

[4]熊大胜,席在星,邓应威.鱼腥草提取物抑菌作用研究[J].常德师范学院学报(自然科学版),2002,14(4):59-60.

[5]胡汝晓,李珊,谭周进,等.鱼腥草内生微生物的分布特征初探[J].生物技术通报,2008,(2):155-157.

[6]杨春平,寇阳,谢婷,等.鱼腥草内生放线菌的分离及杀菌活性研究[J].安徽农业科学,2010,38(18):9584-9586.

Optimization of Fermentation Conditions forEndophyticActinomyceteF03 fromHouttuyniaCordataand Preliminary Study on Antibacterial Active Substances

YU Zhe,ZHANG Shuang

(CollegeofPharmacy,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Connerce,Xianyang712000,China)

Abstract：F03 is an Endophytic actinomycete with strong antibacterial activity,which was separated from Qinling Mountains wild Houttuynia cordata root.Using S.aureus as an indicator bacterium,single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the carbon source,nitrogen source of the medium and fermentation conditions.The antibacterial active substances of the fermentation broth was studied.The optimal culture medium was as follows:glucose 30 g,sucrose 10 g,soybean powder 10 g,peptone 10 g,K2HPO4 0.3 g,NaCl 1 g,CaCO3 2 g,distilled water 1 000 mL.The optimal fermentation conditions were as follows:initial pH value of fermentation broth 8,fermentation time 7 d,fermentation temperature 28 ℃,shaking speed 140 r·min-1,inoculum 7%.The antibacterial active substances had good thermal stability and acid-base stability.The results of paper chromatography of Doskochilova solvent systems showed the main antibacterical active substance to S.aureus was water-soluble metabolite.

Keywords：Endophytic actinomycete;optimal culture medium;fermentation condition;optimization;Houttuynia cordata;antibacterial active substance

中图分类号：TQ 920.6

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)02-0050-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.011

作者简介：于哲(1989-)，女，陕西三原人，助教，研究方向：天然药物化学，E-mail：529741506@qq.com。

收稿日期：2015-11-02