厚朴麻黄汤对哮喘大鼠气道炎症的影响

张川林　陈志斌　李　希　王春娥　王斌灿福建中医药大学附属第二人民医院　350000　福州市五四路282号



厚朴麻黄汤对哮喘大鼠气道炎症的影响

张川林陈志斌李希王春娥王斌灿
福建中医药大学附属第二人民医院350000福州市五四路282号

摘要目的：观察厚朴麻黄汤对哮喘大鼠气道炎症及肺部组织形态学的影响，探讨其作用机制。方法：SD大鼠60只随机分成正常对照组、哮喘模型组、厚朴麻黄汤组和地塞米松组，除正常对照组外，其余各组均采用卵蛋白诱导大鼠建立迟发性哮喘反应模型。左肺肺泡灌洗行细胞计数，放射免疫法和硝酸还原酶法测定肺泡灌洗液（BALF）中ET-1和NO含量；右肺组织进行HE染色，观察肺组织形态学变化。结果：哮喘模型组肺泡灌洗液中的细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数均较正常对照组明显增加，而厚朴麻黄汤组和地塞米松组均较哮喘模型组明显下降（均P<0.05）；与正常对照组比较，哮喘模型组NO、ET-1水平显著升高（P< 0.01）；与哮喘模型组比较，厚朴麻黄汤组和地塞米松组NO、ET-1水平都显著降低（P<0.01），但厚朴麻黄汤组和地塞米松组间NO、ET-1水平比较无显著性差异（P>0.05）。结论：厚朴麻黄汤能明显减轻气道炎症，此可能为其治疗支气管哮喘的药效机制。

关键词厚朴麻黄汤；哮喘；气道炎症；实验研究

支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病［1］，属中医学“哮病”范畴。临床研究表明厚朴麻黄汤对哮病患者具有较好的疗效，能明显改善患者咳嗽、咳痰、气喘症状。但目前有关其作用机制研究较少，为此本文建立哮喘大鼠模型，研究厚朴麻黄汤对哮喘大鼠气道炎症NO、ET-1及肺组织形态学的影响，探讨厚朴麻黄汤对哮喘干预治疗的作用机制。现报道如下。

1　实验材料

1.1动物健康SPF级SD大鼠60只，6周龄，体重180～200 g，雌雄兼用，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。

1.2试药厚朴麻黄汤：厚朴15 g，麻黄12 g，生石膏30 g，杏仁9 g，半夏9 g，干姜6 g，细辛6 g，小麦30 g，五味子6 g。生药材购买于福建中医药大学附属第二人民医院。先加1 000 ml水将小麦煮熟，去渣留汤，加诸药武火煮至沸腾（15 min），再文火煎煮1.5 h。煎煮2遍，2次取汁混合，放入旋转蒸发仪中蒸发得到浓缩液，含生药1.2 g/ml。地塞米松（福州海王福药制药有限公司，国药准字H35020461，规格：5 mg/ml）；OVA（Sigma公司，批号：1001988502A5378-10G）。

1.3试剂NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）；ET-1放射免疫试剂盒（北京普尔伟业生物科技有限公司）。

2　方　法

2.1动物分组及哮喘模型建立［2］

将大鼠随机分成4组：正常对照组、哮喘模型组、厚朴麻黄汤组和地塞米松组，每组15只。除正常对照组外，其余各组均采用卵蛋白诱导大鼠建立迟发性哮喘反应模型。即第1天和第8天腹腔内注射抗原混悬液（每毫升含10 mg卵蛋白、100 mg氢氧化铝）致敏。第15天起，将大鼠置于密闭玻璃容器内，超声雾化吸入1%卵蛋白溶液激发哮喘，每天1次，每次20 min，共雾化2周。地塞米松组每次激发前1 h以地塞米松0.5 mg/kg腹腔内注射；正常对照组用生理盐水腹腔内注射和超声雾化吸入；哮喘模型组灌服生理盐水10 ml/kg；厚朴麻黄汤组每天按12 mg/kg灌服厚朴麻黄汤，灌胃容量为10 ml/kg。各组灌服时间均为30 d。造模及用药过程观察动物的一般状况，如精神状态、呼吸、饮食、大小便等情况。

2.2支气管肺泡灌洗液（BALF）的收集处理最后1次激发24 h后，以10%戊巴比妥液30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，下腔静脉放血致死。气管插管，行左肺肺泡灌洗术，用生理盐水5 ml注入大鼠左侧气管肺组织内，反复抽吸3次，回收率达80%以上，1 500 r/min离心15 min，计细胞数后行瑞氏-姬姆萨法染色，在400倍显微镜下，至少数200个细胞，行细胞分类。

2.3肺组织病理学检查取大鼠右肺部组织放入10%的福尔马林液中固定24 h后，经80%、90%、100%乙醇及正丁醇脱水后，置于60℃蜡盒内，包埋后切片，进行HE染色，封片后在奥林巴斯显微镜下观察肺组织形态学变化。

2.4肺组织切片HE染色肺组织蜡块做厚度为5 μm的连续冠状切片，经过脱蜡、入水等操作后，置苏木精水溶液中染色3 min，入酸水及氨水中分色；流水冲洗后入蒸馏水片刻，分别置70%及90%乙醇溶液中各10 min进行脱水；最后加入酒精伊红溶液染色3 min，染色后的切片再经低浓度至高浓度乙醇溶液脱水及二甲苯透明处理；切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固。

2.5生化检查NO检测采用硝酸还原酶法测定，利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原成NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。ET-1检测采用ELISA法分析测定，按说明书要求操作。

2.6统计学处理所有统计数据采用SPSS17.0统计软件处理。数据以均数±标准差（±s）表示，两组样本均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3　结　果

3.1症状观察实验中哮喘模型组大鼠出现烦躁、不停抓挠头面部、打喷嚏、呼吸加快、静伏不动，严重者伸颈、缩胸、呈喘息状等典型哮喘激发症状［2］。厚朴麻黄汤组和地塞米松组在药物干预后上述症状均有不同程度的减轻。

3.2大鼠BALF中炎症细胞计数和分类哮喘模型组炎症细胞较正常对照组明显增多（P<0.05）；地塞米松组和厚朴麻黄汤组炎症细胞均较哮喘模型组有所下降（P< 0.05）。结果见表1。

表1　各组大鼠BALF细胞总数和分类计数比较　　（±s）

表1　各组大鼠BALF细胞总数和分类计数比较　　（±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与哮喘模型组比较，②P＜0.05

淋巴细胞（×105/L）正常对照组　27.31±5.21　2.98±0.97　0.67±0.34　3.45±0.79哮喘模型组　131.75±8.37①　16.35±1.71①　41.37±4.39①　21.57±2.18①地塞米松组　61.31±6.53②　9.15±1.39②　7.23±1.16②　11.13±1.91②厚朴麻黄汤组　79.23±3.87②　11.63±1.87②　15.37±2.11②　14.38±2.10②组别　　细胞总数（×105/L）n　　剂量（mg/kg）15　　—15　　—15　0.5 15　12.0中性粒细胞（×105/L）嗜酸性粒细胞（×105/L）

3.3各组大鼠BLAF中NO、ET-1水平的比较与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠BALF中NO、ET-1含量明显升高（P<0.01）；与哮喘模型组比较，厚朴麻黄汤组可明显降低模型大鼠BALF中NO、ET-1水平（P<0.01）；厚朴麻黄汤组NO、ET-1含量与地塞米松组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

3.4肺组织HE染色结果见图1。镜下见正常对照组大鼠肺组织形态正常，无明显炎症反应；哮喘模型组大鼠肺组织炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主；地塞米松组及厚朴麻黄汤组较哮喘模型组炎性细胞浸润明显减轻。

表2　各组大鼠BLAF中NO、ET-1水平的比较　　（±s）

表2　各组大鼠BLAF中NO、ET-1水平的比较　　（±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.01；与哮喘模型组比较，②P＜0.01

组别　n正常对照组　15哮喘模型组　15地塞米松组　15剂量（mg/kg）　NO（μmol/L）　ET-1（pg/ml）——0.5 13.13±1.15 33.87±4.03①22.54±2.59②31.75±3.51 67.12±4.37①48.01±7.89②厚朴麻黄汤组　1512.0　25.51±3.16②　41.05±4.73②

4　讨　论

气道炎症是所有类型哮喘的共同病理特征，是临床症状和气道高反应性的基础，存在于哮喘的所有时段。呼出气NO可评估哮喘相关的气道炎症程度，NO含量越高，气道炎症越严重，吸入激素治疗后NO含量可降低，目前临床已把NO含量作为哮喘控制的指标之一，并作为降级治疗的参考依据［3］。ET-1是目前发现最早的支气管收缩活性物质。呼吸系统有广泛的ET-1 和ET-1受体分布，对肺通气功能和循环变化有重要调节作用［4］。ET-1含量升高可诱使前列环素、15-脂肪氧合酶及氧自由基等形成增加，损伤肺上皮细胞，使炎性细胞聚集，分泌多种炎性介质而诱发加重哮喘［5］。

中医学认为，支气管哮喘属“哮病”“伏饮”等范畴。哮病是由于宿邪伏肺，遇感引触的一种发作性痰鸣气喘疾患［6］。“痰饮伏肺”“脾肾阳虚，肾不纳气”是本病的夙根，复感外邪是其发作的诱因，痰遇风动，痰随气升，肺气郁闭，不得宣通为基本病机［7-8］。支气管哮喘呈现慢性病程，反复发作，治疗上较为困难，且长期应用激素，副作用较大，临床费用较高，相比之下中医中药治疗该病有优势。

本实验中所选方剂厚朴麻黄汤出自《金匮要略》，曰“咳而脉浮者，厚朴麻黄汤主之”。其病机为内有痰饮，遇寒引触，相互搏结，壅遏肺气，肺气不利，难以宣降而发为气喘。若寒饮久郁或阳盛体质，寒饮化热，可见烦躁。厚朴麻黄汤以厚朴泄满下气为君药，麻黄、杏仁宣肺降逆，又以细辛、干姜、半夏温化寒饮，石膏清解郁热，五味子酸敛肺气，小麦护胃安中，全方共奏散饮除热、止咳平喘之功。

本研究发现哮喘模型组大鼠BALF中NO、ET-1水平显著升高，提示哮喘气道和肺组织内NO、ET-1释放增加。厚朴麻黄汤组可明显降低哮喘模型大鼠BALF中NO、ET-1含量，与地塞米松组比较无显著性差异（P>0.05）。提示厚朴麻黄汤可能是通过抑制肺泡灌洗液中NO、ET-1的合成和释放，减少支气管和肺组织中炎症浸润，从而减轻哮喘气道炎症，达到降低气道高反应性的效果。

参考文献

［1］中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.中国支气管哮喘防治指南（基层版)［J］.中华结核和呼吸杂志，2013，36（5）：331-336.

［2］曹珊珊,孙轶秋.支气管哮喘动物模型制备的研究［J］.中国中医急症，2012，21（10）:1574-1575.

［3］陈灏珠，林果为，王吉耀.实用内科学［M］.14版.北京：人民卫生出版社，2013:1705.

［4］Dosanjh A，Zuraw B.Endothelin-1（ET-1）decreases human bronchial epithelial cell migration and proliferation：implications for airway remodeling in asthma［J］.J Asthma，2003，40（8）：883-886.

［5］Nikolaou E，Trakada G，Prodromakis E，et al.Evaluation of arterial endothelin-1 levels，before and during asleepstudy，inpatientswith bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respiration，2003，70（6）：606-610.

［6］中华中医药学会肺系病分会.支气管哮喘中医诊疗专家共识（2012）［J］.中医杂志，2013，54（7）:132-138.

［7］王成阳，李泽庚，彭波.阳和平喘颗粒对虚寒哮喘模型豚鼠防治及作用机制的研究［J］.现代中医药，2007，27（2）:36-40.

［8］乔赟，周烨，叶晶，等，龙脷平喘汤急性毒性和抗气道炎症的实验研究［J］.广西中医药，2012，35（2）：53-55.

（2015-11-18收稿/编辑陈明伟）

·中药方剂·

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1003-0719（2016）01-0066-03