PKH26标记的人脐带间充质干细胞在大鼠子宫内膜的示踪

韩　华，赵红伟，康进生，高海祥(.河北省人民医院妇一科,河北 石家庄 05005；.河北省人民医院消化科，河北 石家庄 05005；.河北省人民医院功能神经外科,河北 石家庄 05005；.河北省人民医院呼吸科,河北 石家庄 05005)



·论著·

PKH26标记的人脐带间充质干细胞在大鼠子宫内膜的示踪

韩华1，赵红伟2，康进生3，高海祥4(1.河北省人民医院妇一科,河北 石家庄 050051；2.河北省人民医院消化科，河北 石家庄 050051；3.河北省人民医院功能神经外科,河北 石家庄 050051；4.河北省人民医院呼吸科,河北 石家庄 050051)

[摘要]目的观察PKH26标记人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesencymal stem cells,UC-MSCs)在大鼠子宫内膜的迁移分布情况，评价PKH26的标记和示踪效果。方法分离、培养UC-MSCs, 应用PKH26进行细胞标记, 将标记细胞经尾静脉移植入大鼠体内，荧光显微镜下观察细胞向子宫内膜迁移情况。结果PKH26标记后细胞形态和生长活力无明显差别，荧光显微镜下可见几乎所有标记细胞呈红色荧光，主要分布于大鼠子宫内膜腺上皮和间质中。结论PKH26荧光标记是一种安全有效的标记UC-MSCs的方法，可以用于干细胞移植方面的研究。

[关键词]间充质干细胞移植;子宫内膜；细胞标记

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.006

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类多向分化潜能的成体干细胞，能进行高度自我更新，在体外可以诱导分化为骨骼、肝脏、脂肪、神经等多种组织细胞[1-2]，具有向受损组织归巢、修复重建病变器官的特点[3-4]。其中人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesencymal stem cells,UC-MSCs)具有获取简便、免疫原性弱、增殖能力强、细胞含量高等优点，已成为组织工程、基因治疗和再生医学研究中理想的干细胞来源。而在干细胞移植的研究中，选择合适的方法对干细胞进行标记和示踪是非常重要的。本研究应用PKH26在体外标记培养的UC-MSCs，并将其经尾静脉途径移植到大鼠体内，观察其在子宫内膜迁移情况，评价PKH-26标记和示踪UC-MSCs的效果，旨在为下一步应用UC-MSCs移植修复子宫内膜损伤奠定实验基础。

1材料与方法

1.1标本来源选取2014年3月—2014年5月河北省人民医院妇产科收治的正常足月剖宫产新生儿脐带5份。排除母儿各种传染性疾病及家族遗传病，获得产妇及家属知情同意。

本研究经医院伦理委员会批准。

1.2实验动物、主要试剂及仪器实验动物采用未交配的SD雌鼠5只，8～10周龄，体质量220～260 g，购自河北省实验动物中心。主要试剂及仪器有PKH26试剂盒(Sigma公司)、DMEM/F12培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶/EDTA消化液(Hyclone公司)、超净工作台、荧光显微镜、流式细胞仪、培养箱、离心机、无菌培养瓶等。

1.3UC-MSCs的分离、培养无菌取剖宫产新鲜脐带约10 cm，用生理盐水洗去脐带中残留血液，剪成2～3 cm的小段，再次进行漂洗，从脐带中间纵行剖开，剔除其内1条脐静脉、2条脐动脉，剥离华通胶。用眼科剪将华通胶剪碎成1 mm3的小组织块，转移至细胞培养瓶中，向其中加入含有体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，在5% CO2、37 ℃的培养箱中静置培养。用倒置显微镜每天观察细胞生长情况。于1周后首次换液，此后3～4 d换液1次。观察细胞长至80%～90%融合时，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化传代，在显微镜下控制消化时间。

1.4UC-MSCs的鉴定取第3代细胞，达到80%～90%融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成1×106/mL的细胞悬液，然后用流式细胞仪检测CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45的表达。

1.5用PKH26标记UC-MSCs(组织免疫荧光染色)取经鉴定的UC-MSCs，制成单细胞悬液，DMEM/F12培养液洗涤细胞，加入稀释液C重悬细胞。按PKH26试剂盒说明书操作，在染色之前，将PKH26 染料应用液(250倍稀释)置入离心管，然后迅速将细胞液加入PKH26染液中，立即用吸管均匀、快速混合样品，25 ℃孵育5 min，定时轻轻混匀充分，加入等量血清中止染色反应，孵育1 min，用完全培养液稀释，离心，去上清，将细胞团转入新的离心管中，PBS洗涤3次。加10 mL完全培养液，离心，重新悬置细胞至所需浓度,然后在荧光显微镜下观察细胞的染色情况和荧光强度。随机选取其中5个视野，计算标记率(暗视野下红色荧光细胞数/明视野下细胞总数)，平均值即为PKH26的即时标记率。

1.6PKH26标记的UC-MSCs在大鼠子宫内膜组织中的示踪观察每日固定时间段行大鼠阴道涂片检查，观察大鼠动情周期，将PKH26标记的UC-MSCs 1 mL经尾静脉途径注射到动情期大鼠体内，于移植后2个动情周期的动情期处死大鼠，取大鼠子宫制成冰冻切片，荧光显微镜观察PKH26标记的UC-MSCs在大鼠子宫内膜组织的分布。

2结果

2.1 UC-MSCs的形态观察及生长情况从脐带组织中分离出华通胶，接种后1～2 d组织块开始贴壁，7 d后可见部分细胞从组织块周围爬出，形态呈梭形、纺锤形，局部可成集落生长，14 d左右细胞可形成片状融合达80%，呈旋涡状形态生长，即可进行1∶3传代。细胞传代后生长能力明显增强，形态呈现均一的长梭形，类似成纤维细胞，成典型的旋涡状排列生长(图1～3)。此外，细胞在增殖传代过程中形态无明显变化。

2.2UC-MSCs表面标志物测定用流式细胞仪检测UC-MSCs的免疫表型，结果看到，原代培养的UC-MSCs能够高表达CD44、CD90、CD105，但仍然表达一定程度的CD34、CD45，而第3代的UC-MSCs高度表达CD29、CD44、CD90、CD105等间充质细胞标志，几乎不表达CD34、CD45等造血细胞、内皮细胞标志和主要组织相容性抗原HLA-DR。

2.3UC-MSCs的标记情况经PKH26标记后，UC-MSCs在荧光显微镜下观察呈红色荧光，细胞轮廓清晰，胞膜完整，红色染料均匀分布在细胞表面，标记率达100%。继续培养24 h后观察，标记细胞贴壁生长，形态良好(图4)。

2.4标记细胞子宫内膜示踪观察PKH26标记的UC-MSCs经尾静脉移植到大鼠体内，移植后2个动情周期，荧光显微镜下可见标记细胞散在分布于子宫内膜间质和腺上皮中，表现呈红色荧光(图5)，而未经移植的正常大鼠子宫内膜未见红色荧光。

图1 第1代细胞第1天的细胞形态(×100)

Firgure1 CellmorphologyofP1-1d(×100)

图2 第1代细胞第2天的细胞形态(×100)

Firgure2 CellmorphologyofP1-2d(×100)

图3 第1代细胞第4天的细胞形态(×100)

Firgure3 CellmorphologyofP1-4d(×100)

图4 PKH26标记的UC-MSCs(免疫荧光染色×200)

Firgure 4UC-MSCs labeled with PKH26 (immunofluorescence staining ×200)

图5PKH26标记的UC-MSCs在大鼠子宫内膜组织和腺上皮的分布(免疫荧光染色 ×200)

A、B、C为子宫内膜组织；D、E、F为子宫内膜腺上皮

Firgure 5Distribution of UC-MSCs labeled with PKH26 in endometrial tissue and glandular epithelium(immunofluorescence staining ×200)

3讨论

MSCs是来源于中胚层间充质的成体干细胞，具有全能干细胞的特点，能进行多向分化，主要存在于骨髓、脐血、脐带、外周血等组织中。目前临床和科研应用MSCs的主要来源是骨髓和脐带组织。由于骨髓取材困难、有创伤、易污染，且随着年龄老化细胞数量和分化能力相对减少和减弱，因而限制了其临床应用。与其相比，人脐带组织作为“医疗废物”，取材方便，来源广泛，不存在伦理问题，且细胞含量高、增殖能力强、免疫原性低，可为实验和临床提供充足的MSCs来源[5]。因此，本实验中采用脐带组织，从脐带华通胶中提取MSCs，采取尾静脉注射方式移植入大鼠体内，观察干细胞移植后在体内的迁移分化。

为追踪观察干细胞移植后在体内的存活、迁移和分布情况，将干细胞加以标记，以便进行识别和监测[6]。目前，常用的细胞标记方法有基因转染标记法如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)[7]、荧光染料标记法[8]、荧光原位杂交标记法[9]、核酸标记法如5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU) 、磁共振成像技术[10]、近红外荧光成像技术[11]、Y染色体标记示踪、常染色体标记示踪、循环细胞标记示踪[12]等。其中，GFP的具体半衰期还未知，不利于在实验中对时间的掌控，并且一些物理因素(如高温等)和化学因素(如强酸等)可以破坏它的水化层或双电层，对其进行降解。BrdU的标记率尚不理想，且细胞凋亡后释放出的BrdU可能会掺入处于细胞周期S期的任何细胞，使移植细胞和宿主细胞难以辨别，因此可能会出现假阳性结果。磁共振成像技术标记效率高、细胞毒性小，但对试剂和检测设备要求较高。Y 染色体标记检测试剂价格昂贵，应用较困难。PKH26是一种亲脂性的荧光染料，与细胞膜脂质区发生不可逆的结合，对细胞进行荧光标记，并发出红色荧光，产生稳定、清晰、精确的荧光标记细胞。既往研究表明，PKH26标记的细胞种类广，对细胞无明显的不良反应[13]，不影响细胞增殖、凋亡[14]，标记后的细胞仍保留原有的生物学特性，而且标记强度稳定，具有良好的可重复性，因此目前主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示踪研究[15]。本研究中对UC-MSCs进行PKH26标记，结果显示标记细胞和未标记细胞的生长状态、凋亡周期、增殖能力均无明显差别，表明PKH26标记后，UC-MSCs的生物学特性无明显改变，可用于研究UC-MSCs在体内的迁移示踪。实验中，将标记细胞经尾静脉途径移植入正常大鼠体内，移植后2个动情周期观察，荧光显微镜下可见子宫内膜间质和腺上皮均有红色荧光标记，而正常大鼠子宫内膜未见红色荧光标记物，表明PKH26可作为体内示踪的一项有效标记方法。但本研究中只是采用正常大鼠，尚未对大鼠建立子宫内膜损伤模型，在下一步实验中我们将应用无水乙醇致使大鼠子宫内膜损伤，应用干细胞进行移植修复，观察经PKH26标记的干细胞在子宫内膜的示踪情况。

综上所述，应用PKH26标记UC-MSCs简便易行、标记率高、染色速度快、染色后不影响细胞生长特性，可示踪UC-MSCs在体内的迁移分布情况，为下一步进行干细胞移植修复子宫内膜损伤奠定了实验基础。但本实验仅观察了细胞移植后2个动情周期的组织形态，没有进行长期观察，因此可以在后续的实验中进一步研究远期示踪效果，观察PKH26的长期示踪情况。

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(本文编辑：许卓文)

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《河北医科大学学报》编辑部

Tracing effect of PKH26-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells in endometrium of rats

HAN Hua1， ZHAO Hong-wei2， KANG Jin-sheng3， GAO Hai-xiang4

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China; 2.Department of Gastroenterology, the People′s Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050051, China； 3.Department of Neurosurgery, the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China；4.Department of Respiration,the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China)

[Abstract]ObjectiveBy labeling the human umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs) with PKH26, the migration of cell in endometrium of rats were observed. Labeling and tracing effects of PKH26 were evaluated. MethodsIsolated human UC-MSCs were labeled with PKH26.The labeled cells were transplanted to rats through caudal vein. Then the distribution of cells in rat endometrium was observed under fluorescence microscope. ResultsThere were no detectable differences in cell morphology and growth after PKH26 labeling. And the cells were mainly labeled with red fluorescence under inverted fluorescence microscope and were mainly distributed in epithelial cells and stromal cells, in endometrial glandular epithelium and mesenchyme.ConclusionLabeling the human UC-MSCs with PKH26 is a safe and effective method, which can be used in the study of transplantation of stem cells.

[Key words]mesenchymal stem cells; endometrium; cells labeling

[中图分类号]R617

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)03-0268-04

[作者简介]韩华(1982-)，女，河北邯郸人，河北省人民医院主治医师，医学硕士，从事妇产科疾病诊治研究。

[基金项目]河北省卫计委青年科技课题(20150122)

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-03