奶牛支原体性乳房炎病原的分离鉴定

曾伟权 （广东省博罗县福田畜牧兽医站 516131）



奶牛支原体性乳房炎病原的分离鉴定

曾伟权 （广东省博罗县福田畜牧兽医站 516131）

摘要本文从有乳房炎临床症状的奶牛中采集牛奶样本，经细菌培养和支原体培养、通过菌落形态观察、生化试验、特异性PCR鉴定和16SrRNA测序比对对分离株进行鉴定，证实为牛支原体感染，同时还有其他细菌的混合感染。

关键词奶牛 支原体 感染 乳房炎

牛支原体(Mycoplasma bovis)作为感染牛的一种重要的致病性支原体，可以引起包括肺炎、乳腺炎、关节炎、生殖道损伤以及结膜炎等在内的多种疾病，同时还可与其他病原协同，造成继发感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 内蒙古某地奶牛场无菌采集并送检的患病奶牛的乳样14份。

1.1.2 培养基 培养基为PPLO液体培养基，配方为：

PPLO 2.1g/100ml、D-Glucose 0.1g/100ml、酚红250μl/ 100ml、酵母浸出液1ml/100ml(300ml/L)、灭活马血清

20ml/100mi、青霉素(200UI/ml)、葡萄糖(4g/L)、丙酮酸钠(2g/L)，用1mol/L NaOH调pH至7.6～7.8，置4℃保存备用[1]。

1.1.3 仪器设备 37℃温箱、显微镜、冰箱(4℃、20℃)、

PCR仪、离心机、水浴锅、电泳仪、低温台式高速离心机为SIGMAD公司产品；YY2Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪为北京六一仪器厂产品；PTC200、PCR仪为BIO-RAD公司产品；凝胶成像系统为BIO-RAD公司产品。

1.1.4 主要试剂 革兰氏染色液、瑞氏染色有、姬姆萨染色液、葡萄糖生化鉴定管、精氨酸生化鉴定管、四氮唑生化鉴定管等。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 将送检的奶样用高压灭菌后的棉签蘸取划线涂抹于伊红美兰平板培养基、高盐甘露醇平板培养基、血平板培养基和普通琼脂平板培养基，培养皿倒置于37℃恒温培养箱内培养18～24h。观察培养后的培养基上划线处长出的菌落形态，用接种环轻轻刮取不同菌落形态的细菌，革兰氏和美兰染色油镜下观察细菌形态，同时刮取少量细菌按同样的方法再次涂于普通琼脂培养基进行纯培养。

1.2.2 牛支原体的培养 吸取1ml奶样经滤膜过滤加入到

PPLO液体培养基中，同时用高压灭菌后的棉棒蘸取送检奶样均匀涂于PPLO固体培养基表面，一起放入盛有蜡烛的灭菌干燥缸内，平板用封口膜封好并倒置，点燃蜡烛盖严干燥缸，待蜡烛熄灭后放置于37恒温培养箱内，培养3～5d后，在倒置光学显微镜下观察菌落形态。挑取单个菌落克隆接种液体培养基，待生长后再接种固体培养基，至少3次克隆纯化后，将菌种冻存，保存于-80℃。支原体液体培养基由红色变为黄色，并且清亮；固体培养基上的菌落呈油滴状、发暗、没有晕圈，经传代培养后，菌落会呈现出典型的“油煎蛋”样外观。

1.2.3 涂片镜检 （1）革兰氏染色：将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革兰氏典液，作用1min，水洗。滴加脱色酒精，约30s。结果：革兰氏阳性呈紫色；革兰氏阴性呈红色。（2）姬姆萨染色：于5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加5～10滴姬姆萨染液原液，即稀释为常用的姬姆萨染液；抹片甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或抹片浸入盛有染色液的染缸中，染色30min，取出水洗，吸干，镜检。细菌呈蓝青色，组织细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。牛支原体呈淡紫色。（3）瑞氏染色：取病料涂片、自然干燥，滴加瑞氏染液染3min，使标本被其中甲醛所固定；加等量pH6.4的磷酸盐缓冲液轻轻晃动玻片，均匀静置5min；水洗、吸干、镜检。细菌染成蓝色，组织细胞胞浆红色，细胞核蓝色。牛支原体呈淡紫色。

1.2.4 牛支原体生化鉴定 将分离纯化的细菌增菌后进行发酵葡萄糖、水解精氨酸试验、水解尿素试验、四氮唑还原试验、需要胆固醇试验。（1）发酵葡萄糖和水解精氨酸试验：将待检支原体接种于支原体液体培养基中，内含0.5%葡萄糖或0.2%精氨酸，观察培养基的颜色变化。同时设置阴、阳性对照组。（2）水解尿素试验：支原体培养基中不加葡萄糖和精氨酸而加入0.1%尿素，调pH至5.5～6.0，接种待检支原体后最终pH上升，观察培养基的颜色变化。同时设置阴、阳性对照组。（3）四氮唑还原试验：氯化四氮唑1g，蒸馏水50ml 溶解后用除菌过滤器过滤除菌待用。配制支原体培养基不加葡萄糖精氨酸和酚红而加入0.02%氯化四氮唑，调pH到7.0～7.2.接种待测支原体培养，37℃温箱培养2周，观察培养基的颜色变化。同时设置阴、阳性对照组。（4）需要胆固醇试验：取支原体的培养基两管，其中一个加马血清，另一个不加马血清。然后在两管中分别平行接种待测支原体的培养物。观察来那个两管中的支原体的长状态确定此次分离的菌株生长是否需要胆固醇。

1.2.5 牛支原体PCR的鉴定 使用北京全式金生物技术有限公司的支原体基因组DNA抽提试剂盒提纯培养物基因组DNA。利用牛支原体特异性引物P1: 5`－TTTTAGCTCT TTTGAACAAAT－3`，P2: 5`－GGCTCTCATTAAGAATG TC－3`。

1.2.6 16S rRNA序列测序与分析 根据已发表文献[2]报道的方法扩增支原体培养物16SrRNA基因序列，预计扩增片段长度为238pb。将PCR扩增产物连接到T载体中送去南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序，利用BLAST软件将测序结果与部分支原体菌株的16SrRNA序列进行比对分析。

1.2.7 牛支原体药物敏感性试验 采用纸片扩散法[3]，即在“超净台”中用吸管滴加纯培养菌液1滴(约0.02ml)于鲜血琼脂平板上，用L棒将菌液均匀涂布，加盖后放置10min左右，待平板面稍干，将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏纸片平放在琼脂平板上，并轻压使其紧贴平板表面，药敏纸片一旦接触平板即不再移动，每种药敏片的名称在平皿背面做好标记。将贴好纸片的平板置于37℃温箱中置于5%CO2培养2～3d，2～3d后观察并测量抑菌圈直径(包括药敏纸片直径)，并与标准抑菌环直径相比较，得出结论。此次药敏试验选用的药敏片有：左氧氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，红霉素，链霉素，卡那霉素，庆大霉素。

表1　药敏实验参考标准 (mm)

2 结果与分析

2.1 发病牛的临床症状

自2012年11月起内蒙古某奶牛场相继出现高产奶牛感染乳房炎，患牛乳区发热、乳房红肿(图4)；患牛乳汁呈粘稠状、絮状、脓汁甚至血乳；患牛精神沉郁、食欲减退；其中一头牛蹄部肿胀，出现跛行。

2.2 细菌分离鉴定结果

从送检的奶样中分别分离到形状为短杆状排列分散的细菌、短杆状呈簇状排列的短杆菌、圆形球菌和圆形小球菌，染色镜检后，根据菌体形态及染色特性初步判定这些细菌分别为大肠杆菌、克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和支原体。

2.3 支原体分离结果

在液体培养基中盲传2代后，3份样品的培养基颜色开始变黄，呈轻微混浊状。将培养物纯化，获得3份纯培养物。将纯培养物接种于固体培养基上，72h后可以观察到乳白色、针尖状大小的菌落，倒置低倍普通光学显微镜下可看到菌落呈圆形，边缘整齐，具有典型的“油煎蛋状”形态，如图1。

2.4 镜检结果

2.4.1 革兰氏染色 革兰氏染色呈阴性，见图2。

图1　牛支原体“油煎蛋”样外观

图2　革兰氏染色

2.4.2 姬姆萨染色 干燥后用800～1000倍显微镜观察。呈淡紫色，菌为多形态，以球点状最常见。结果见图3。2.4.3 瑞氏染色 干燥后用显微镜观察，呈淡紫色，见图4。

图3　姬姆萨染色

图4　瑞氏染色

2.5 牛支原体生化鉴定

四氮唑还原试验反应管呈红色，与阳性对照相同，所以判定为阳性。加葡萄糖的、甘露醇、精氨酸的培养支原体反应管均不变色，与阴性对照相同，所以判定为阴性。培养基中加尿素的反应管不变色，仍然呈黄色，与阴性对照相同，所以判定为阴性。在加了血清的培养基成长良好，证明此次分离的支原体的生长需要血清中胆固醇。这些生化反应与己报道牛支原体生化特性相符，因此从牧场分离的支原体为牛支原体。

表2　生化反应结果

2.6 PCR鉴定

用灭菌镊子夹取高压灭菌后10μl枪头从固体平皿上挑取已纯化后的支原体菌落加入盛有150μl灭菌水的Eppendorf管中，煮沸5min，冰浴1min，12000r/min离心30s，取上清作为DNA模板，同时直接将传代培养的菌液作为模板。利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆至质粒pMD18-T(宝生物工程大连有限公司)中，委托上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

图5　分离物的PCR 扩增结果

2.7 16 S rRNA基因序列分析

对16S rRNA扩增产物进行测序分析，利用BLAST软件进行序列同源性比较，结果表明所分离支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)。

图6　GT-01和 CT-02分离株16S rRNA基因序列的同源性分析

2.8 牛支原体药物敏感性试验

支原体没有细胞壁结构，对所有β内酰胺类、糖肽类等抗生素固有耐药性，大环内酯类、喹诺酮类药物对其有抑制作用。支原体对药物的敏感性常用最低抑菌浓度(MIC)表示，本试验选择大环内酯类、喹诺酮类药物对牛支原体的最低抑菌浓度进行初步测定，结果表明牛支原体对红霉素的耐药性最低，其次是恩诺沙星、诺氟沙星，对环丙沙星的耐药性最高，因此牛支原体性乳房炎的首选药物为吡喹酮类药物，以提高临床治疗效果[15]。

表3　药敏实验结果

3 讨论

（1）在牛支原体乳腺炎的诊断方面，对其进行确诊仍然需要进行病原体的分离鉴定及核酸诊断。牛支原体的分离培养鉴定虽然能够确诊，但操作复杂，所需条件高；生理生化特性检查，包括葡萄糖发酵试验和精氨酸水解试验、尿素水解试验，血清学鉴定也可以作为牛支原体的辅助诊断方法[4]。PCR方法有较高的特异性和灵敏性，且鉴定结果与生理生化方法鉴定结果的符合率为100%，显示了较高的特异性、敏感性及符合率。PCR方法不仅提高了检测的准确性，还缩短了鉴定时间，具有广泛的应用前景，故该方法为乳房炎病原菌的快速鉴定提供依据和方便。（2）牛支原体对大部分抗生素不敏感，大部分在体外药敏试验结果中表现敏感的药物，在支原体乳房炎临床治疗时却不能产生良好的效果，有研究者认为这可能与奶牛血乳屏障阻碍药物进入乳腺有关[5]。另据报道中西药结合治疗牛支原体乳房效果好，中药用瓜蒌散加味，西药用四环素、红霉素、土霉素以及卡那霉素等四环素类抗生素进行治疗[7]。在积极治疗原发病的同时，也应采取相应的对症治疗措施，如发热的牛可用安乃近、复方氨基比林等解热药；体质弱的牛补充能量和维生素C、复合维生素B、ATP等，亦结合樟脑注射液等进行强心治疗。（3）分离株与牛支原体标准株的同源性为99.6%，进一步从基因序列水平上证实了分离株为牛支原体。（4）从送检的奶样中分离到支原体的同时，也少量分离到大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等，这可能是因为支原体感染后的继发感染。牛支原体病是严重危害养牛业的传染性疾病，深入开展牛支原体致病机制、免疫原性等方面的研究，开发高效的牛支原体相关诊断试剂，从而有效防控牛支原体乳房炎，以促进我国奶牛养殖业健康快速发展。

参考文献

[1] 毕丁仁, 王桂芝. 动物霉形体及研究方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 1998.

[2] 石磊, 龚瑞, 尹争艳等. 肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断[J].华中农业大学学报, 2008, 27(5): 629-633.

[3] 陈坤永, 翁良树, 吴慕贞等. 深圳地区奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验[J]. 中国兽医科技, 1999, 29(9): 36-38.

[4] 杨建伟, 肺炎支原体感染的抗生素药敏分析Journal of Medical Forum, Vol. 32 No 1672 3422 (2011) 16-0099-0220-21.

[5] 赵忠德, 徐作仁, 张升华. 奶牛支原体性乳房炎的诊断与治疗[J].黑龙江畜牧兽医, 2006, 6: 71.

[6] 冀贞阳. 治疗牛支原体病药物的选择[J]. 养殖技术顾问, 2006, 10: 49.

[7] 张海成, 张玉青. 中西药结合治疗支原体性乳房炎[J]. 中兽医医药杂志, 2008, 4: 70-71.

收稿日期：（2015–10–15）

中图分类号：S858.23

文献标识码：A

文章编号：1007-1733(2016)03-0001-03