向日葵菌核病生防菌的筛选与鉴定

何思宇，李婷婷，郭晶晶，李晓全，韩 冰

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

菌核病是向日葵的一种常见病，又称烂盘病、白腐病，病原为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。自发现该病以来，它的发病面积一直在不断扩大，发病率也在不断地上升，这种病害在向日葵主产区里每年发病率在50%左右，有时可高达70%以上[1]。对向日葵的品质和产量影响很大，也给农民带来了巨大的经济损失。菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）真菌侵染引起的病害。在条件适宜的情况下，菌核开始萌发，可直接形成菌丝侵染寄主，也可形成子囊盘产生子囊和子囊孢子，子囊孢子随风雨传播到寄主表面后，发芽成菌丝，侵染致使向日葵发病。该病导致向日葵的茎折、根茎部腐烂、花盘、叶及种仁腐烂等。花盘受害时，从底面到表面布满白色绒毛状菌丝层，内有黑色菌核。茎部发病时，病部表面有白色绒毛状的薄膜，褪色后，形成灰白色圆形或椭圆形斑点[2]。

目前，应用的防治方法主要是药剂防治，用40%纹枯利800～1000倍液或50%托布津可湿性粉剂1000倍液在向日葵现蕾前或在盛花期喷洒1～2次。用50%速克灵500～1000倍液在苗期或开花期喷洒[3]。目前，虽然药剂防治和抗病育种的方面取得了一些成果，但药物防治成本高且会对环境造成污染，而抗病育种的收效不大。

生物防治具有安全、环保、成本低等特点。许多学者在生物防治方面都做了尝试。张一名从向日葵根围土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌，通过拮抗实验发现核盘菌菌丝生长点附近出现明显的异常分枝和囊泡状畸形，在距该菌株一定范围内核盘菌不能形成菌核[4]。王鹏研究表明，一种非致病菌尖孢镰刀菌产生的环孢素a能够抑制核盘菌菌丝的生长和菌核的形成，因此环孢素a可作为生防剂；同时发现假单胞菌的2个不同菌株能很好地抑制核盘菌子囊孢子初期萌发[5]。还有其他研究表明，链霉菌、地衣芽孢杆菌、辣椒溶杆菌、油菜假单胞菌均属于向日葵菌核病生防菌[6]。本研究通过平板对峙培养、盆栽试验方法对从内蒙古自治区巴彦淖尔市采摘的向日葵花盘和根进行生防菌的系统分离筛选，以期找到对向日葵菌核病菌有显著抑制作用并能适应内蒙古生态条件的优良生防菌株。

1 材料和方法

1.1 试验材料

生防细菌分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗采集的5株未感染病的向日葵根及花盘。向日葵菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）由内蒙古农业大学植物病理室提供。

1.2 试验方法

菌株的分离、纯化：将供试向日葵的根和花盘表面消毒后，加无菌水和石英砂充分研磨，稀释成10-1、10-2、10-3共3个梯度，吸取每个梯度研磨液20 μL分别涂布3个马铃薯葡萄糖培养基（PDA）和3个牛肉膏蛋白胨培养基（NA）。置于24°C恒温培养箱培养1～7 d，依据菌落形态、颜色、透明度、光滑度等特征，挑取单菌株，纯化保存。

1.3 生防菌的筛选

1.3.1 拮抗菌的初筛 采用平板对峙培养法进行拮抗试验。在PDA平板上中心处接种直径6 mm病原菌菌饼，在距离中心3 cm互相垂直的4个点接种不同的待测菌株，每一组合重复3次，以中央只接种病原真菌的平板为对照，放于培养箱中24°C培养。

1.3.2 拮抗菌的复筛 将病原菌菌饼反贴于PDA培养基中央，于24°C下培养，待病原菌菌落直径长到2 cm时，用接种环挑取待测菌株，从病原真菌的一侧沿与其生长方向相交的方向划线接种[7]；对照实验：以S.sclerotiorum为指示菌，以枯草芽孢杆菌为测试菌，作阳性对照组；以不接菌株和以无菌水代替测试菌为空白对照组；以培养基代替测试菌为环境对照组。

1.3.3 抑菌带的测量 以S.sclerotiorum为指示菌，将病原菌菌种预先培养在PDA平板上待菌落长至5 cm直径，用打孔器打取6 mm直径菌块，接种在培养皿中央，在周围等距离用穿刺法接种待测菌株，24°C下72 h后观察抑菌带宽度。并观察抑菌带附近菌丝形态。

1.4 菌株N9、N22的形态特征和细菌生理生化特征的测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]中假单胞菌属和沙雷氏菌属的鉴定方法进行形态学、革兰氏染色、氧化酶、接触酶、淀粉水解、柠檬酸盐利用、脓青素的产生、明胶液化、耐盐度等特性的鉴定。

1.5 细菌的分子生物学鉴定

1.5.1 菌种DNA提取 CTAB法提取DNA[9]。用1%浓度琼脂糖水平凝胶电泳检测DNA完整性。

1.5.2 PCR扩增16S rDNA序列 以细菌总DNA为模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）为引物扩增N9和N22的16S rDNA序列，目的片段长度为1400 bp 左右。 PCR 体系为：10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mM dNTPs 4.0 μL，Forward Primer（10 μM）1.0 μL，Reverse Primer （10 μM）1.0 μL，模板 DNA 3.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，加ddH2O至终体积50.0 μL。PCR反应条件为94℃预变性3 min；94℃变性35 s；55℃退火 45 s；72℃ 延伸 1.5 min；30个循环后；72℃延伸8 min。

1.5.3 16S rDNA序列测定及分析 将PCR产物直接进行测序，测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。测序结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，采用MEGA 6.0程序的Neighborjoining算法构建系统发育树。

1.6 盆栽向日葵的生防实验

1.6.1 向日葵种子的处理 在超净台中，用75%的酒精和1%的次氯酸钠对向日葵种子表面消毒后用发酵48 h生防菌原液浸泡种子30 min。

1.6.2 土壤处理 将购买的营养土与蛭石1∶1混合，土壤高温灭菌后装入15 cm×15 cm的花盆内，将处理过的向日葵种子播种，出苗后每盆留苗1株。每盆接入菌核5 g[10]，撒于盆栽表土上，上覆2 cm厚的薄土，用前面所筛效果最好的两种生防菌N9和N22发酵原液处理土壤，发酵原液按用量分别为25 mL、50 mL、100 mL 3个梯度处理[10]，B为只接病原菌处理、C为空白对照各3个处理（表1）。对照植株发病后测定发病率和防治效果。

发病率/%=［病株数/总处理株数］×100

防治效果/%=［（对照发病率-处理发病率）/对照发病率］×100[11]

表1 实验处理

1.6.3 生物量及株高的测定[12]实验结束后测量向日葵的株高，再置于65°C条件下烘干至恒重。分别记录地上生物量、地下生物量、总生物量。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的筛选

从向日葵植株的根及花盘中分离得到187个分离物，经过平板对峙法的初筛和复筛获得4株具有拮抗作用的细菌，分别为 N3、N9、N18、N22。从平板对峙法的结果看，N9和N22在不同时期都对核盘菌有较好的抑制效果。枯草芽孢杆菌（阳性对照）抑菌带宽度为0.5 mm、N22抑菌带宽度为3.0 mm、N9抑菌带宽度为2.8 mm。

设枯草芽孢杆菌为阳性对照，由图1看出N22、N9的拮抗效果比枯草芽孢杆菌的拮抗效果强。与空白对照组比较，菌株N22、N9抑菌带附近的核盘菌在一定范围内不能形成菌核；空白组菌丝生长旺盛，有菌核生成。由于培养核盘菌的培养基与培养N22、N9的培养基不同，为排除培养基成分对核盘菌生长的影响，特设环境对照组表明培养基成分对核盘菌生长无影响。

2.2 N9、N22的形态学鉴定

透射电镜下，放大20000倍后观察到，N9为杆状菌且有极生鞭毛，菌体大小为（0.3～0.4）μm×（0.9～1.2）μm，革兰氏染色为阴性。在NA固体培养基上生长24 h后，菌落可产生橙色色素，圆形，不透明，表面凸起，光滑，较黏稠，易挑起，边缘整齐。N22为短杆状菌且有周生鞭毛，菌体大小为（0.5～0.7）μm×（1.5.～1.8）μm，革兰氏染色为阴性。在NA固体培养基上生长24 h后，菌落表面光滑不透明，可产生红色色素，圆形，较黏稠，易挑起，边缘整齐。

2.3 生理生化特征分析

N22、N9及标准菌株黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生理生化特征进行实验。生理生化实验标准菌株：黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）从中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）购买。

由表2可知，N9能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生H2S，能利用卵磷脂酶，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。最适生长的NaCl浓度为2%～5%，当NaCl浓度为5%时菌落颜色为白色，NaCl浓度为7%时不生长。

表2 细菌生理生化特征分析

N22能水解脂酶、过氧化氢酶、明胶、七叶灵、不水解精氨酸双水解酶、氧化酶、脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、也不产生H2S，能利用柠檬酸盐、丙二酸。最适生长的NaCl浓度为2%～7%，NaCl浓度为7%时只有少量单菌落，菌落颜色为白色，NaCl浓度为10%时不生长。

2.4 16S rDNA序列分析

将N9和N22的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后。结果表明，N9与假单胞菌属有较高的同源性，与绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis，DQ682655）有99%的相似性。N22与沙雷氏菌属的细菌有较高同源性，与深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea，AB004571）相似性达100%。

将N9和N22的序列在NCBI数据库分析后，构建系统发育进化树。结果见图 3，N9与Pseudomonas chlororaphis形成最小分支，N22与Serratia rubidaea形成最小分支。依据N9和N22的生理生化特征及建树结果，将N9鉴定为绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），N22鉴定为深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）。

2.5 盆栽向日葵的生防实验

将筛选到的N9和N22作为供试菌，试验所用向日葵供试种子为GE817，进行盆栽向日葵菌核病的防治效果比较。结果见表3。试验结果表明，N9和N22两株供试拮抗菌发酵原液处理土壤的不同用量对向日葵菌核病均表现出一定的控制效果。其中N22拮抗菌株25 mL发酵原液处理土壤后对向日葵菌核病的防效均达到最高，其防治效果为100%。从防治效果看（表3），2个菌株处理土壤的发酵原液用量对向日葵菌核病的防效存在显著差异，同比之下N22的防治效果更好一些。N9与N221∶1混合发酵原液处理的向日葵有明显的促生长作用（表4）；其中50 mL发酵液处理的向日葵株高效果最佳，其中100 mL发酵液处理的向日葵生物量最高。

表3 拮抗菌株N9和N22对向日葵菌核病盆栽防治效果

表4 拮抗菌株N9和N22对向日葵植物生长的影响

3 讨论与结论

化学药剂防治菌核病，不仅会使核盘菌产生抗药性，并且对环境也造成了严重的污染，给食品安全问题带来了隐患。利用生防菌防治向日葵菌核病是生物防治的重要手段，此方法具有不产生抗性，不污染环境，仅抑制或杀伤防治对象，保持生态平衡，能参与生态环境调控，起到长效作用等优点。因此，筛选拮抗能力稳定的生防菌对菌核病的防治具有重要的意义。生物防治是目前植物病害防治研究的热点之一，但主要集中于生防菌的分离、筛选、生物学特征以及拮抗机理等方面的研究，但应用于生产实际并具有良好防治效果的相关报道较少。

N9和N22两种菌株对向日葵的菌核病均有一定的防治效果，但尝试将两种菌株混合在一起后处理被核盘菌侵染的向日葵，拮抗效果并不好，可能由于菌种之间的相互作用降低了对病原菌的拮抗作用，其抑菌机理还有待进一步研究，但却发现N9与N22发酵原液混合后处理未染病的向日葵有明显的促进生长发育的作用。根据形态观察和生理生化指标测定，查看《常见细菌系统鉴定手册》可知，菌株N9的生理生化结果与绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）相符；菌株N22的生理生化结果与深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）基本相符，但N22的V.P实验结果为阴性，而查看《常见细菌系统鉴定手册》，深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）的V.P实验结果为阳性，怀疑N22为深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）的另一亚种。

N9鉴定为绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），大量研究表明此菌为重要的生防菌，陈怀谷研究发现绿针假单胞菌对于小麦全蚀病具有明显的防治效果，由于绿针假单胞菌菌株能在小麦根际定植，所以由该菌株制成的生防菌剂有较长的持效期，并且其使用不会带来环境问题，有利于小麦的无公害生产[13]。王远山研究表明绿针假单胞菌对烟草黑胫病病原菌烟草疫霉有很强的拮抗作用，该菌株对烟草疫霉菌丝体有很强的抑制作用，并且可以完全抑制烟草疫霉游动孢子对烟草幼苗的侵染[14]。何延静从甜椒根际土壤中分离得到绿针假单胞菌，研究发现对辣椒疫霉具有强拮抗作用[15]。但对向日葵菌核病的防治国内外均未见报道。在本实验中我们发现，绿针假单胞菌对核盘菌也有很好的抑制效果。为向日葵菌核病的生物防治提供了理论基础。

N22鉴定为深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）。沙雷氏菌（Serratia）属肠杆菌科，在自然界分布很广，能产生非水溶性黄、紫、红色素的革兰氏阴性小杆菌，一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。是引起医院内感染的重要条件致病菌。姜立春以华蓥山香菇作为研究材料，培养得到一株附生细菌，并鉴定为深红沙雷氏菌[16]。目前国内外关于深红沙雷氏菌在植物方面的报道很少，其对向日葵菌核病的防治国内外均未见报道。

本研究证实了绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）和深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）对向日葵菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）有很好的抑制作用。经盆栽防效试验所筛生防菌N9和N22，还需要在田间对其生防效果作进一步测试。此外，它的生物学特性、抑菌机理、活性物质成分也值得进一步研究，以探明其在生物防治中的应用潜力。

参考文献：

［1］杨 涛，李汉华，段 维，等.向日葵菌核病的防治现状及前景［J］.现代农业，2014（10）：24-25.

［2］高宏博，赵 清，王冬艳，等.向日葵几种常见病害的识别与防治［J］.现代农业科技，2013（22）：119-128.

［3］卜浩宇，张 贵，侯亚光，等.不同向日葵品种资源对菌核病抗性的田间鉴定［J］.内蒙古农业大学学报(自然科学版)，2014（5）：30-37.

［4］张一名，李小娟，王 颖，等.抑制向日葵核盘菌菌核形成的生防菌S-16的鉴定及其生防作用研究［J］.中国生物防治学报，2014，30（1）：121-127.

［5］刘新涛，刘玉霞，倪云霞，等.西瓜枯萎病拮抗细菌的筛选［J］.河南农业科学，2008，37（9）：94-96.

［6］刘建军.向日葵菌核病的发生及防治［J］.山西农业科学，1986，14（11）：38.

［7］侯启会，杜秉海，靳 奉，等.向日葵菌核病拮抗菌XRK5的筛选与鉴定［J］.微生物学报，2010，37（8）：1200-1204.

［8］东秀珠.常见细菌鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［9］浦寅芳，马桂珍，暴增海，等.核盘菌菌核重寄生菌的分离筛选［J］.河南农业科学，2008，37（11）：80-83.

［10］王 春，王 芊.黑龙江向日葵菌核病拮抗菌株的分离与筛选［J］.中国农学通报，2013，29（33）：346-350.

［11］李小娟.向日葵菌核病生防菌的筛选鉴定及其综合防治［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2012.

［12］梁 曦，苏德荣，杨云贵.灌水对冷季型混播草坪生物量的影响［J］.草地学报，2008，16（1）：60-64.

［13］陈怀谷.一种绿针假单胞菌及其应用［P］.中国发明专利，CN103602621，2014（2）：26.

［14］王远山，王 平，胡正嘉.绿针假单胞菌PL9菌株对烟草疫霉的拮抗作用研究［J］.华中农业大学学报，2002，21（3）：248-251.

［15］何延静，刘海明，胡洪波，等.一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的分离与鉴定［J］.微生物学报，2006，46（4）：516-521.

［16］姜立春，甘 毅，阮期平.一株产紫红色色素的沙雷氏菌的分离与鉴定［J］.安徽农业科学，2008，36（28）：12082-12084.