板蓝根多糖在C57小鼠抗结核感染中的作用*

向 田，刘 杲，杨 瑾

1 恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000；2 湖北民族学院中医学院

板蓝根多糖在C57小鼠抗结核感染中的作用*

向 田1，刘 杲1，杨 瑾2

1 恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000；2 湖北民族学院中医学院

目的：探讨板蓝根多糖对结核感染小鼠的作用及其机制。方法：提取板蓝根多糖配制成悬液后尾静脉注射感染毒性结核分岐杆菌H37Rv C57小鼠，按照50 mg/kg的量对板蓝根多糖治疗组小鼠腹腔注射板蓝根多糖溶液，连续注射1周，对照组注射等量的生理盐水。观察比较各组小鼠的生存率，脾脏、肺脏的病理变化及抗酸染色分析菌落数，用酶联免疫吸附法测定小鼠脾脏细胞释放的细胞因子，流式细胞术检测脾脏CD4、CD8阳性T细胞比例。结果：经板蓝根多糖治疗的结核感染小鼠，生存率较对照组明显提高，脾脏及肺脏的病理变化减轻，肺脏菌落数较对照组明显降低，脾脏细胞分泌的细胞因子IFN-γ水平提高，白细胞介素-4(IL-4)变化无统计学意义，CD8 T细胞比例升高。结论：板蓝根多糖能够通过刺激Th1型细胞因子的产生进而增强C57小鼠的细胞免疫应答来抗结核分岐杆菌的感染。

结核分岐杆菌；Th1型细胞因子；细胞免疫；板蓝根多糖

目前，结核病仍然是威胁人类生命健康的重要传染病之一，全球每年因结核病死亡约200万人，每年有约800万结核病新发病例［1］。近年来，随着免疫缺陷病毒(HIV)的流行传播以及结核分岐杆菌耐药株的不断出现，导致全球结核病疫情更加严峻，被称为21世纪的癌症［2-3］。我国肺结核患者中耐药率达8.32%［4］，给结核病的治疗带来了更为严峻的挑战，因此急需开发新的抗结核病的治疗药物。

板蓝根为十字花科植物菘篮和草大青的根，含有谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸以及丰富的多糖成分(板蓝根多糖)［5］。相关研究［6-9］表明，板蓝根具有较好的抗菌、抗病毒作用，对大肠杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、流感病毒以及非典型肺炎病毒(SARS病毒)等有较好的抑制作用；同时有研究［10-11］进一步证实板蓝根多糖可显著提高小鼠免疫功能，对氢化可的松所致免疫功能抑制小鼠脾指数、白细胞总数和淋巴细胞数的降低有明显对抗作用；此外，板蓝根多糖还能明显增强抗体形成细胞功能［12］。

基于此，本研究将提取的板蓝根多糖应用于毒性结核分岐杆菌H37Rv感染的C57小鼠模型，以观察板蓝根多糖对抗结核感染的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性C57小鼠，体质量18～20 g，购自武汉大学ABSL-3实验动物中心，实验动物合格证号：42000600013383，在该动物中心SPF级环境中饲养并完成所有实验。

1.2 药物及试剂板蓝根颗粒(湖北民族学院医学院杨瑾老师惠赠)；毒性结核分岐杆菌H37Rv(武汉市医疗救治中心提供)；小鼠IFN-γ、IL-4的ELISA试剂盒(购自eBioscience公司)；7H9结核培养基(购自BD公司)；小鼠FITC标记的CD4抗体、PE标记的CD8抗体(均购自eBioscience公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 结核感染小鼠及分组 取7H9结核培养基中的结核分岐杆菌H37Rv并计数，将浓度调整为5×107CFU/mL，每只小鼠取100 μL进行尾静脉感染。感染后第5天将C57小鼠分为板蓝根多糖治疗组及磷酸盐缓冲溶液(Phosphote buffer，Saline，PBS)对照组，每组12只，并设正常组12只。同时按照50 mg/kg的量对板蓝根多糖治疗组小鼠腹腔注射板蓝根多糖溶液，连续注射1周，对照组注射等量的PBS。从治疗开始后每天观察小鼠的生存情况，连续观察30天并做记录。

1.3.2 脾脏、肺脏HE染色 30天后将小鼠颈椎脱臼处死后解剖分离脾脏和肺脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后行常规HE染色，显微镜下观察。

1.3.3 菌落计数 无菌条件下取2组小鼠肺组织，然后按每1 g质量的肺组织加1 mL生理盐水，研磨成匀浆；以此原液作10倍梯度稀释；选取3个稀释度的悬液100 μL，分别涂布于改良罗氏培养基上，于37℃培养箱中培养16天后进行菌落计数。

1.3.4 ELISA法分别检测小鼠脾细胞IFN-γ以及IL-4 无菌条件下取小鼠脾脏，然后按每1 g组织加1 mL含有10%胎牛血清的1640培养基，无菌研磨并过滤成单细胞悬液；将脾细胞接种于6孔细胞培养板中培养48小时后，收集培养上清，按照ELISA试剂盒说明检测上清中IFN-γ以及IL-4的表达。

1.3.5 小鼠脾脏CD4、CD8T细胞比例检测 将小鼠眼球放血，将血收集于含25 U/mL肝素的EP管中，然后同时加入5 μL的FITC标记的抗鼠CD4以及PE标记的抗鼠CD8抗体，避光室温孵育30分钟，破除红细胞后上流式细胞仪进行检测。1.4 统计学方法使用GraphPad Prism软件分析数据，计量资料以(±s)表示，采用配对t检验，秩和检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 C57小鼠生存率在毒性结核分岐杆菌H37Rv感染后第8天，PBS对照组小鼠开始死亡，到第20天，已经死亡一半，第30天仅2只存活；而板蓝根多糖治疗组小鼠在第14天开始死亡，第30天有7只存活(P=0.0209)，见图1。

2.2 小鼠脾脏、肺脏HE染色变化情况将小鼠脾、肺分别做HE染色后发现(放大倍数为100倍)，经板蓝根多糖多次治疗的结核感染小鼠脾脏淋巴多而集中，肺脏结构基本完整；而PBS对照组与正常组小鼠脾脏比较，淋巴分散甚至消失，肺泡融合及实变严重，见图2。

图2 小鼠脾脏、肺脏HE染色情况

2.3 小鼠肺脏菌落计数菌落计数(每mg log 10 CFU/mL)结果显示板蓝根多糖治疗组为(5.52± 0.1778)CFU/mL，明显少于 PBS对照组(8.96± 0.1005)CFU/mL(P=0.0022)，见图3。

图3 小鼠肺脏菌落计数

2.4 小鼠脾细胞IFN-γ以及IL-4变化情况 无菌制备小鼠脾细胞，收获培养上清后测定IFN-γ以及IL-4的表达，发现板蓝根多糖治疗组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ表达增加(P＜0.0001)，而IL-4无明显变化(P=0.1320)，见图4。

2.5 小鼠脾细胞中CD4+T细胞及CD8+T细胞比例经板蓝根多糖治疗的结核感染小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞增多，与PBS对照组相比差异具有统计学意义(P=0.005)，见图5。

图4 小鼠脾细胞IFN-γ以及IL-4变化

图5 小鼠脾细胞中CD4+T细胞及CD8+T细胞比例

3 讨论

板蓝根是常用的清热解毒类中药，多糖是其发挥各种治疗作用的重要成分之一［13］。临床上常用来预防或治疗流行性感冒病毒、乙肝病毒、乙型脑炎病毒等病毒感染［14-15］。同时，现代研究发现，板蓝根具有一定的抗肿瘤作用，如梁永红等［16］发现板蓝根可以抑制肝癌BEL-7402细胞及卵巢癌细胞A2780的增殖等；大量研究证实，板蓝根是一种具有广谱抗菌作用的药物，包括抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌等。郑剑玲等［17］证实板蓝根各级提取物包括乙醇提取液、正丁醇萃取液等对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制作用。

另外，板蓝根在抗菌的同时能够增强动物机体的免疫功能。实验证明板蓝根多糖对特异性、非特异性免疫细胞免疫均有促进作用，腹腔注射板蓝根多糖(50 mg/kg)可显著增强小鼠的免疫功能。夏新中等［18］将板蓝根多糖多次腹腔注射感染毒性鼠伤寒杆菌的小鼠后发现，板蓝根多糖可以通过增强小鼠的体液免疫、细胞免疫进而显著延长小鼠的生存率。张红英等［19］以板蓝根多糖作为免疫增强剂联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫仔猪，证明板蓝根多糖能显著提高仔猪外周血中CD8+淋巴细胞的百分数，增强猪对常规灭活病毒疫苗的免疫应答能力。

本研究首次将板蓝根多糖应用于小鼠的结核感染模型中，实验结果证实，以50 mg/kg的量腹腔注射结核感染的小鼠后，与生理盐水对照组相比，板蓝根多糖治疗组可以显著延长结核感染小鼠的生存率；小鼠脾、肺分别做HE染色后发现，经板蓝根多糖多次治疗的结核感染小鼠脾脏淋巴多而集中，肺脏结构基本完整；而生理盐水对照组与正常小鼠脾脏比较，病理变化较重，淋巴分散甚至消失，肺泡融合及实变严重；小鼠肺脏菌落计数显示，板蓝根多糖治疗组小鼠肺脏菌落数明显少于生理盐水对照组；进一步免疫学检查发现，板蓝根多糖可以促进结核感染小鼠脾脏细胞Th1型细胞因子IFN-γ的分泌，对Th2型细胞因子IL-4的分泌几乎没有影响；同时，板蓝根多糖还可增加小鼠脾脏CD8+T的比例。以上研究结果初步证明，板蓝根多糖可能通过活化CD8+T细胞以及促进Th1型细胞因子的产生发挥抗结核感染作用，其抗结核的具体机制还需进一步探讨。

［1］ Dye C，Scheele S，Dolin P，et al.Consensus statement. Global burden of tuberculosis：estimated incidence， prevalence，and mortality by country.WHO Global Surveillance and Monitoring Project［J］.JAMA，1999，282(7)：677-686.

［2］ Anon.China takes action against tuberculosis and HIV co-infection［J］.Lancet，2010，376：488.

［3］ Migliori GB，Sotgiu G，Lange C，et al.Extensively drugresistant tuberculosis：back to the future［J］.Eur Respir J，2010，36(3)：475-477.

［4］ 成诗明.我国结核病研究概况［J］.中国防痨杂志，2011，33(9)：525-526.

［5］ 王蓓.板蓝根的基础研究及临床应用［J］.广西民族大学学报：自然科学版，2006，12：119-130.

［6］ 胡淑平，丁涛，张殿文，等.复方板蓝根含片的抗菌作用及对免疫功能的影响［J］.中药药理与临床，2007，23(5)：188-190.

［7］ 孔维军，赵艳玲，山丽梅，等.微量热法研究板蓝根中四种有机酸对微生物生长代谢的影响［J］.生物工程学报，2008，24(4)：646-650.

［8］ 王瑞军.几种中草药对金黄色葡萄球菌体外抑制作用的研究［J］.现代食品科技，2009，25(9)：1104-1106.

［9］ 胡兴昌，郑伟强.板蓝根粗提液抑制流感病毒的实验研究［J］.上海师范大学学报，2003，32(1)：62-65.

［10］李苑，陈亦，胡兴昌.板蓝根枸杞提取液对小鼠免疫机能影响的比较［J］.上海师范大学学报：自然科学版，2006，35(5)：83-86.

［11］储岳峰，李祥瑞，胡元亮.9种中药成分对小鼠免疫细胞活性的影响［J］.南京农业大学学报，2004，27(1)：97-100.

［12］王晓丹，李慧庆.板蓝根药理作用研究进展［J］.黑龙江医药，2010，23(2)：241-243.

［13］李成义，杨苗苗，张樱山，等.甘肃不同产地板蓝根中多糖含量分析［J］.西部中医药，2015，28(2)：5-7.

［14］赵丽.板蓝根药理作用、临床应用及不良反应［J］.河北中医，2010，32(7)：1059-1060.

［15］彭爱红.板蓝根药理活性成分及临床应用进展［J］.中国当代医药，2010，17(12)：13-14.

［16］梁永红，侯华新.板蓝根二酮B体外抗癌活性研究［J］.中草药，2000，31(7)：531-533.

［17］郑剑玲，王美惠，杨秀珍.大青叶和板蓝根提取物的抑菌作用研究［J］.中国微生态学杂志，2003，15(1)：18-19.

［18］夏新中，肖静，石国芳，等.板蓝根多糖对宿主抵抗鼠伤寒沙门菌感染能力的影响［J］.武汉大学学报：医学版，2007，28(3)：348-350.

［19］张红英，赵现敏，崔保安，等.板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪T细胞亚群的影响［J］.中国免疫学杂志，2007，23(2)：134-137.

Effect of Isatis Root Polysaccharide in C57 Mice with Anti Tuberculosis Infection

XIANG Tian1,LIU Gao1,YANG Jin2
1 The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China; 2 College of Traditional Chinese Medicine,Hubei Institute for Nationalities

A

1004-6852(2016)11-0007-04

2015-12-22

2011年湖北省自然科学基金计划项目 (编号2011CDC018)。

向田(1981—)，女，在读博士研究生，主管技师。研究方向：分子及感染免疫。