流感丸中乌头碱的限量检查及HPLC含量测定方法的建立

刘高宏，魏立莉

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

流感丸中乌头碱的限量检查及HPLC含量测定方法的建立

刘高宏，魏立莉

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

目的：建立流感丸中乌头碱的限量检查及HPLC含量测定方法。方法：采用薄层色谱法对流感丸中乌头碱进行限量检查；采用高效液相色谱法测定流感丸中乌头碱的含量。结果：薄层色谱方法简便、专属性强，乌头碱在8.0～20 μg/mL范围内呈良好线性关系，平均加样回收率为98.85%(RSD%=1.43%)。结论：该法稳定、快速、简便，结果准确、可靠，可用于流感丸中乌头碱的限量检查及含量测定。

流感丸；乌头碱；限量检查；高效液相色谱法

流感丸是由诃子、亚大黄、木香、镰形棘豆、酸藤果、角茴香、阿魏、榜嘎等制成的复方制剂，具有清热解毒之功效。用于流行性感冒，主治流清涕，头痛咳嗽，周身酸痛，高热等症。流感丸为藏族验方，原质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(95年版藏药第一册)［1］。方中榜那和榜嘎为乌头属植物［2］，乌头属植物多含有乌头碱，为了用药的安全性，参照《中国药典》2010版一部附子理中丸项下乌头碱限量检查［3］，对该制剂乌头碱限量的检查方法进行研究，同时采用HPLC对流感丸中的乌头碱进行含量测定［4］。

1 材料

1.1 仪器LC-10A高效液相色谱仪，包括SPD-6AV紫外可见检测器、C－R4A数据处理机(日本岛津)；641旋转蒸发仪(BüCHI瑞士)；HS-6150D型超声波清洗仪(上海钦森实验仪器有限公司)；SK-M2型サンプルミル粉碎器(日本)；AE-260 AE-240型电子天平(瑞士)；HHS21-8型电热恒温水浴锅(常州诺基仪器有限公司)；CS101-30型电热鼓风干燥箱(北京环创科学仪器有限公司)；TGL-16G型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药流感丸(青海柴达木药业科技有限公司，批号：20100102)；乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：110798-200805)；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，并经0.45 μm滤膜过滤，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 乌头碱限量检查

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 供试品溶液的制备 取本品6 g，研细，加氨试液3 mL，再加乙醚25 mL，放置过夜，滤过，残渣加乙醚洗涤两次，25 mL/次，滤过，合并上述滤液，低温挥干，残渣加三氯甲烷10 mL使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷洗涤容器2次，10 mL/次，洗液并入分液漏斗中，用0.05 mol/L硫酸溶液提取4次(20、10、10、10 mL)，合并酸液，加氨试液调节pH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20、15、15 mL)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.1.2 乌头碱对照品溶液的制备 取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液。

2.1.1.3 不含榜那及榜嘎阴性对照溶液的制备 按处方比例及制备工艺，配制不含榜那、榜嘎的阴性对照品，并依照上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照药材溶液。

2.1.2 鉴别 吸附剂：硅胶G板。点样量：对照品溶液3 μL和7 μL，供试品溶液10 μL。展开剂：甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(7∶2∶0.5)。显色剂：稀碘化铋钾试液。

2.1.3 限量检查结果 日光下检视，供试品色谱中，在与乌头碱对照品色谱相应的位置上出现的斑点大小介于对照品低标与高标斑点之间。查阅相关文献，参照《中国药典》一部制附子项下乌头碱限量计［3］，以高标为限度，规定供试品色谱中，在与乌头碱对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品斑点。经多人多次重复操作结果稳定，阴性无明显干扰，见图1。

图1 流感丸中乌头碱薄层色谱图

2.1.4 样品含量限度的确定 经查阅相关文献，参照《中国药典》一部制附子项下乌头碱限量计［3］，乌头碱对照品浓度为2 mg/mL，点样量为5 μL，乌头碱量为10 μg，取样量为20 g，样品点样量为6 μL，样品定容为2 mL，最高服用量为15 g，由此算得附子一次最高服用量所含乌头碱限度为2.5 mg。以此为据，本品乌头碱对照品浓度为1 mg/mL，点样量高标7 μL，乌头碱量为7 μg，样品取样量为6 g，点样量为10 μL，样品定容为2 mL，日用量为6 g，即乌头碱日用量为1.4 mg。本品中含乌头碱日用量低于附子的用量。

2.2 HPLC法测定流感丸中乌头碱的含量

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-三乙胺(55∶45∶0.04)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长240 nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于3 000［5］。

2.2.2 溶液的制备［6-11］

2.2.2.1 对照品溶液的制备 取乌头碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含乌头碱0.2 mg溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取其粉末约6 g，精密称定，置锥形瓶中，加氨试液拌匀湿润，加无水乙醚60 mL，静置过夜，超声处理30分钟，过滤，滤渣用无水乙醚洗涤3次，20 mL/次，合并乙醚液，低温挥干，残渣用流动相溶解，并定量转移至5 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取乌头碱对照品储备液0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，按“2.2.1”项色谱条件操作，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，处理得到直线回归方程：Y=6 999.6X+1 921.6，r=0.999 9，线性范围为8.0～20.0 μg/mL。表明在此浓度范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取乌头碱对照品溶液，连续进样5次，20 μL/次，以“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，峰面积的RSD=0.52%，表明仪器进样精密度较好。

2.2.6 重现性试验 取同批流感丸，研细、混匀，取粉末6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，记录色谱图，其RSD为1.22%，表明该方法重现性良好。

2.2.7 回收率试验 采用加样回收法，取已知含量的同批流感丸，研细，混匀，取粉末适量，精密称定，精密加入低、中、高浓度的乌头碱对照品溶液，每个比例制备3份样品。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，记录色谱图，计算回收率，平均回收率为98.85%、RSD为1.43%，符合要求。

2.2.8 样品测定 取10批流感丸，研细，混匀，取粉末适量，精密称定，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，测定，计算10批样品中乌头碱的平均含量为0.13 mg/g，结果见表1、图1。

表1 流感丸中乌头碱的含量测定结果

图1 流感丸中乌头碱HPLC色谱图

3 讨论

本研究采用HPLC对流感丸中的乌头碱进行含量测定。该实验方法简便、灵敏、快速，结果较稳定，可用于流感丸中乌头碱的限量检查及含量测定。

流感丸为藏族验方，原质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(95年版藏药第一册)，其内容简单(只对藏菖蒲和小茴香两味药进行薄层鉴别)，本研究对有毒性的乌头碱进行限量检测，保障了用药安全。

［1］ 中国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：藏药(第一册)［M］.北京：化学工业出版社，1995：330.

［2］ 青海省藏医药研究所，青海省药品检验所.中国藏药［M］.上海：上海科学技术出版社，1996：518.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：792.

［4］ 梅馨，潘金火，杨菁.消痛膏中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的HPLC法测定［J］.中国医药工业杂志，2014，45(10)：962-964.

［5］ 蔡大可，李耿，彭绍忠，等.酸性染料比色法测定痹痛消膏中乌头生物碱的含量［J］.中药新药与临床药理，2007，18(1)：57-59.

［6］ 任欣欣，李兴华，叶莎，等.HPLC法测定复脉灵胶囊中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(18)：131-134.

［7］ 王瑞，刘芳，孙毅坤，等.不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的HPLC测定［J］.药物分析杂志，2006，26(10)：1361-1363.

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［9］ 岳云飞，张丽英，刘永成.改进复方硫酸软骨素片中乌头碱限量检查方法的建议［J］.中国药品标准，2011，12(1)：13-14.

［10］赫清雪，王爱武，王楠楠.3种抗风湿中成药乌头碱限量检查［J］.中国中医药信息杂志，2012，19(9)：59-60.

［11］孙玲，戚敏，钟华风.桂附地黄丸中乌头碱限量检查方法研究［J］.药学研究，2004，23(5)：27-28.

Construction of Aconitine Limited Inspection and HPLC Determination Method in LiuGanWan

LIU Gaohong,WEI Lili
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

A

1004-6852(2016)11-0024-03

2015-11-24

刘高宏(1974—)，男，主管中药师。研究方向：中药炮制及鉴定。