纳米银对荧光假单胞菌生物膜形成的影响

黄迅辰， 杨　维， 戴贤君

(1. 中国计量学院 生命科学学院， 浙江 杭州 310018; 2. 浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室， 浙江 杭州 310018)



纳米银对荧光假单胞菌生物膜形成的影响

黄迅辰1,2， 杨维1,2， 戴贤君1,2*

(1. 中国计量学院 生命科学学院， 浙江 杭州 310018; 2. 浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室， 浙江 杭州 310018)

摘要：分别以空白和0.4%纳米银乙烯醋酸乙烯酯(EVA)塑料片作为载体培养荧光假单胞菌生物膜，通过菌落计数法测定生物膜的变化曲线，分别采用普通显微镜观察生物膜形成并计算覆盖率(BCR)，扫描电镜观察生物膜的微观结构，激光共聚焦显微镜观察生物膜中的细菌状态并计算死亡率.结果表明，空白、纳米银EVA表面生物膜分别在12和24 h达到稳定状态，各时间点的纳米银EVA表面菌数及BCR均显著低于空白EVA(p<0.05)；在10 000倍的视野下，空白EVA表面的荧光假单胞菌通过胞外产物和菌体形成致密生物膜，纳米银EVA表面多为分散菌体；在24,48 h时，纳米银EVA表面的死亡菌体数显著高于空白EVA(p<0.05)；纳米银通过抑制荧光假单胞菌生长和减少胞外产物的分泌而影响生物膜的形成.

关键词：纳米银; 荧光假单胞菌; 生物膜

HUANG Xunchen1,2, YANG Wei1,2, DAI Xianjun1,2

(1.CollegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China; 2.KeyLaboratoryofMarineFoodQualityandHazardControllingTechnologyofZhejiangProvince,Hangzhou310018,China)

荧光假单胞菌是一类革兰氏阴性杆状细菌，具有分布广泛、营养需求单一、繁殖快、能产生水溶性的黄绿色荧光色素等特点[1].荧光假单胞菌在4 ℃时繁殖速度快，是导致冷藏食品腐败的优势菌群[2].

细菌生物被膜(biofilm,BF)是细菌在生长过程中,为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面的一种由细菌和自身分泌的细胞外基质组成的物质[3].与浮游细菌生长方式不同，生物膜细菌在形态结构和生化特性方面亦有显著差异,不仅能有效逃避宿主免疫作用、抗生素杀伤和产生耐药性，而且难以从黏附部位彻底清除，是食品安全的重大隐患[4].

银离子具有广谱杀菌功能,主要通过与细菌接触反应,干扰肽聚糖的合成并阻碍细胞壁的形成,也能破坏微生物的电子传输系统、呼吸系统、物质传输系统,导致细菌死亡[5].纳米粒子是指粒子直径在1～100 nm的粒子,具有独特的纳米晶体结构和更大的接触面积[6].纳米银离子既具有纳米材料独特的性能又具有银离子特有的抗菌特性，比普通银离子具有更好的应用效果[7].因此，纳米银作为无机抗菌剂在食品贮藏保鲜中有潜在的应用价值[8]，但有关纳米银对生物膜形成影响的研究报道较少.

本试验以空白和含纳米银的Ethylene-Vinyl Acetate (EVA) 塑料片为黏附载体，通过结晶紫染色、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等方法观察荧光假单胞菌生物膜的形成过程，以分析生物膜的分布和空间结构，探讨纳米银对荧光假单胞菌生物膜形成的影响及可能机制，旨在为食品生产过程中利用纳米银控制生物膜形成提供依据.

1材料与方法

1.1试剂

荧光假单胞菌由本实验室分离鉴定并保存；结晶紫、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出粉、琼脂、氯化钠购于杭州百思生物技术有限公司；24孔板购于杭州米克化工有限公司；LIVE/DEAD®BacLightTMBacterial Viability Kits(L13152)购于life technologies公司；空白及0.4%纳米银EVA塑料片(1 cm×1 cm×0.5 mm)购于北京崇高纳米有限公司.

1.2试验器材

GR60DF立式自动压力蒸汽灭菌器(厦门致薇仪器有限公司)，BJ-2CD超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，I3型紫外可见分光光度计(济南荷能仪器股份有限公司)，LT-BIX低温生化培养箱(上海立德泰勀科学仪器有限公司)，E200 MVRS型正置显微镜和CISI激光共聚焦显微镜(日本尼康公司)， SIRION100扫描电镜(美国FEI公司).

1.3试验方法

1.3.1材料准备

将空白和含有0.4%纳米银的EVA片用去离子水冲洗，放在丙酮中超声15 min，清洗掉表面的油污，然后放在75%的乙醇中浸泡30 min，洗涤剂清洗；蒸馏水冲洗干净后，放在250 mL的三角瓶中，121 ℃，灭菌20 min.

向无菌24孔培养板的每孔中加入2 mL LB培养基并分成对照组和试验组，对照组培养孔中放入空白EVA片，试验组培养孔中放入纳米银EVA片.

1.3.2纳米银对生物膜菌数的影响

取培养24 h处于对数生长期的荧光假单胞菌液稀释成菌悬液(OD600为0.05)，24孔培养板的每孔接种菌悬液100 μL，25 ℃培养；分别于3,6,9,12,24,36,48,72 h取出空白、纳米银EVA片置于试管，加3 mL无菌水超声10 min，用紫外可见分光光度计在OD600时测定菌液浓度，并在倍比稀释后进行CFU计数，平行试验3组，绘制生物膜曲线.

1.3.3纳米银对生物膜覆盖率的影响

同1.3.2节培养荧光假单胞菌液生物膜，分别于培养6,12,24,48 h时取出空白、纳米银EVA片自然干燥，PBS溶液洗涤后95%体积分数的酒精固定处理生物膜，再用0.5%结晶紫染色5 min后用蒸馏水清洗.处理好后的载体片放在E200正置显微镜下放大10×20倍观测，随机选取3个平行视野拍照，用NIS-Element BR 软件计算生物膜在EVA表面的覆盖率(Biofilm coverage rate，BCR).

1.3.4纳米银对生物膜微观结构的影响

同1.3.2节培养荧光假单胞菌液生物膜，取培养24 h的空白、纳米银EVA片用无菌水清洗，然后置于2.5%戊二醛PBS溶液固定1 h.由于样品本身以及EVA不导电，需要经过临界点干燥并喷金，分别在1 000和10 000倍视野下扫描电镜观察生物膜的微观结构.

1.3.5纳米银对生物膜中细菌状态的影响

按LIVE/DEAD® BacLightTMBacterial Viability Kits试剂说明配制荧光染液，取一支SYT09溶于2.5 mL去离子水配成溶液，一支PI溶于2.5 mL去离子水配成溶液，再将2种试剂溶液按照V∶V=1∶1加入同一离心管，振荡混匀，避光4 ℃保存备用.同1.3.2节培养荧光假单胞菌液生物膜，选取24，48 h的生物膜进行试验，每个时间点选取3组平行.用PBS溶液清洗3次，滴加SYTO9/PI荧光染料，避光孵育20 min，再用PBS溶液清洗3次，50%甘油封片用于激光共聚焦扫描电镜观察.选取氩激光(488 nm)激发，沿Z轴扫描，Image Pro Plus 6.0图像分析处理得到生物膜中的死菌数，计算死亡率.

1.4数据处理

采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，p<0.05表明差异显著.

2结果

2.1纳米银对生物膜菌数的影响

对生物膜进行菌落计数可量化其形成过程，图1说明空白和0.4%纳米银EVA表面均形成荧光假单胞菌生物膜，且2种载体片表面黏附的生物膜表现出相似的生长趋势，但纳米银可明显延迟荧光假单胞菌生物膜的形成.空白EVA表面的生物膜12 h时已基本达到稳定状态，纳米银EVA表面在24 h时才达到稳定状态，而且稳定态时的菌数显著低于空白载体组(p<0.05)，说明纳米银对荧光假单胞菌生物膜的形成有明显的抑制效果.

图1　纳米银和空白EVA表面荧光假单胞菌生物膜的形成曲线Fig.1　The curve of Pseudomonas fluourcens biofilms onthe control and EVA contained 0.4% silver nanoparticles

2.2纳米银对生物膜覆盖率的影响

图2　纳米银和空白EVA表面不同培养时间点的荧光假单胞菌生物膜Fig.2　Pseudomonas fluourcens biofilms on the control and EVA piece contained 0.4% silver nanoparticlesat the different culture times(a) 0.4%纳米银EVA(6 h)；(b) 0.4%纳米银EVA(12 h)；(c) 0.4%纳米银EVA(24 h)；(d) 0.4%纳米银EVA(48 h);(e) 空白EVA(6h)；(f) 空白EVA(12 h)；(g) 空白EVA(24 h)；(h) 空白EVA(48 h).(a) EVA of 0.4% silver nanoparticles(6 h)；(b) EVA of0.4% silver nanoparticles(12 h)；(c) EVA of 0.4% silvernanoparticles(24 h)；(d) EVA of 0.4% silver nanoparticles(48 h)；(e) Control EVA(6 h)；(f) Control EVA(12 h)；(g) Control EVA(24 h)；(h) Control EVA(48 h).彩图详见http://www.journals.zju.edu.cn/sci

图3　空白和纳米EVA不同培养时间点的荧光假单胞菌生物膜BCRFig.3　BCR of Pseudomonas fluourcens biofilms on the control and EVA piece contained 0.4% silver nanoparticles at the different culture time

图2是荧光假单胞菌黏附在EVA上形成生物膜的结晶紫染色状态.从图2(e)、(f)、(g)、(h)可见，荧光假单胞菌可黏附到EVA上逐渐形成致密的生物膜，在12 h时EVA表面已布满生物膜，24～48 h时已非常致密，这同2.1节中生物膜的形成曲线一致.比较图2(a)～(d)与相同时间点的图2(e)～(h)，纳米银EVA表面的生物膜在各时间点均较为稀疏，在24～48 h时的成熟期，其覆盖范围明显低于空白EVA上的生物膜.图3荧光假单胞菌生物膜BCR的柱状图显示，在各个时间点上空白和纳米银EVA表面生物膜的BCR均差异显著(p<0.05)，其中48 h时空白EVA表面的荧光假单胞菌生物膜BCR达到91.8%，而纳米银EVA表面的生物膜BCR为46.8%，说明纳米银在生物膜形成过程中具有持续抑制效果.

2.3纳米银对生物膜微观结构的影响

图4(a)、(b)和(c)、(d)分别是培养24 h时纳米银EVA和空白EVA表面的生物膜在放大1 000倍和10 000倍的扫描电镜照片.对比图4(a)和(b)，发现空白EVA表面的荧光假单胞菌生物膜更为明显、清晰、完整.由图4(d)可见，空白EVA表面的完整生物膜形态，荧光假单胞菌通过自身分泌的黏性胞外产物将其连接成一片，菌体包裹在胞外分泌物中，整个生物膜呈片状，无规则覆盖在载体表面，形成形态不规则的多层结构，图4(c)中纳米银EVA表面的菌体生物膜不及空白EVA表面致密，荧光假单胞菌基本处于分散状态.

图4　空白和纳米EVA表面24 h的荧光假单胞菌生物膜扫描电镜图Fig.4　SEM images of Pseudomonas fluourcens biofilms on the control and EVA contained0.4% silver nanoparticles at 24 h

2.4纳米银对生物膜中细菌状态的影响

图5中(a)、(c)和(b)、(d)分别是在24 ，48 h时空白和纳米银EVA表面的死亡荧光假单胞菌菌体染色结果，染色较浅的为死亡菌体.从图中可见纳米银EVA表面的死亡菌体数量明显高于空白EVA.在24，48 h时空白和纳米银EVA上荧光假单胞菌的死亡率分别为15.1%，52.4%和37.7%，70.1%，同一时间点的菌体死亡数量差异显著(p<0.05).

图5　纳米和空白EVA表面24，48 h死亡荧光假单胞菌的共聚焦显微镜图Fig.5　CLSM images of dead Pseudomonas fluourcens on the control and EVA contained 0.4% silver nanoparticles at 24 and 48 h彩图详见http://www.journals.zju.edu.cn/sci

3讨论

生物膜是由菌体和菌分泌的胞外多糖等基质组成的具有高度结构性、协调性的功能型组织群体[9].生物膜内菌体结构紧密，代谢、运输结构完整，能有效阻止大分子酶类和小分子抗生素进入菌体，较于浮游菌体，其对环境的适应能力、抗性都有增强，因此生物膜难以清除[10].

纳米银具有广谱杀菌、不易产生抗药性、安全性高等优点，已有较多有关纳米银抑制菌株及其作用原理的报道[11].在本试验中，纳米银EVA表面形成的荧光假单胞菌生物膜形成明显滞后于空白EVA，各时间点均差异显著；结晶紫染色图也表明，纳米银EVA表面的荧光假单胞菌生物膜更为稀疏，生物膜覆盖率仅为空白对照的50%左右.扫描电镜能较好呈现生物膜的微观结构，在本试验中，空白EVA表面的生物膜完整、致密，有明显的层次结构，而纳米银EVA表面的生物膜中的菌体呈单个分散状态，菌体数量明显低于空白EVA，说明纳米银在荧光假单胞菌生物膜形成过程中对菌体生长和分泌胞外产物能力产生了明显的抑制作用，而胞外产物的缺乏进一步影响了生物膜的内部微观结构和外部形态.共聚焦显微镜图的结果表明，纳米银EVA表面生物膜死亡菌株显著多于空白EVA，说明纳米银可通过杀菌抑制生物膜的形成.

通过对生物膜的观察及定性、定量分析，发现纳米银通过抑制荧光假单胞菌的生长，减少其胞外分泌产物，从而影响生物膜的形成.纳米银材料在细菌生物膜控制中具有较大的应用价值.

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Effect of silver nanoparticles on biofilm formation ofPseudomonasfluourcens. Journal of Zhejiang University(Science Edition), 2016,43(2):195-199

Abstract:To explore the effect of silver nanoparticles on the formation of Pseudomonas fluourcens biofilms on ethylene-vinyl acetate(EVA) pieces, the curve of bacterial biofilm is determined by colony counts, and the morphology, microstructure and bacterial status of the biofilm are respectively observed through crystal voilet staining, scanning electron microscopy(SEM) and confocal laser scanning microscope(CLSM)．The biofilm stained by crystal violet is examined with a digital microscope to calculate the biofilm coverage rate (BCR) by NIS-Element BR soft ware. Then the mortality of bacterial is calculated by image structure analyzer (ISA) software．Results show that the bacteria can aggregate on the control EVA and EVA contained 0.4% silver nanoparticles, and forms the grown biofilm after 12 and 48 h culture, respectively. But the biofilm on the control EVA has more bacterial count and BCR than that of silver nanoparticles(p<0.05). At 24 h, the bacteria interacting with its extracellular products can form the dense film in the microscope vision of 10 000 times on the control EVA, while there are only dispersive bacteria on silver nanoparticle EVA. The bacterial mortality in the film on silver nanoparticle EVA is significantly higher than that of control group at 24, 48 h (p<0.05). Silver nanoparticles have great inhibiting effect on biofilm formation of Pseudomonas fluourcens through inhibiting the growth of the bacterial and its extracellucar products.

Key Words:silver nanoparticles; Pseudomonas fluourcens; biofilms

中图分类号：R 378.11

文献标志码：A

文章编号：1008-9497(2016)02-195-05

DOI:10.3785/j.issn.1008-9497.2016.02.013

作者简介：黄迅辰(1990-)，男，硕士研究生，主要从事食品微生物研究.*通信作者，ORCID:http://orcid.org/0000-0002-8361-5187,E-mail:xjdai@cjlu.edu.cn.

基金项目：浙江省重大科技专项资助项目(2012C03009-2).

收稿日期：2015-03-31.