新疆哈萨克族肥胖儿童菌群人源化动物模型的建立

刘新彩，徐佩茹，李 敏，艾比白·艾尔肯，王红清

830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院儿科(刘新彩，徐佩茹，李敏，艾比白·艾尔肯，王红清)；新疆维吾尔自治区循证医学研究所(徐佩茹，李敏)



·论著·

新疆哈萨克族肥胖儿童菌群人源化动物模型的建立

刘新彩，徐佩茹，李 敏，艾比白·艾尔肯，王红清

830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院儿科(刘新彩，徐佩茹，李敏，艾比白·艾尔肯，王红清)；新疆维吾尔自治区循证医学研究所(徐佩茹，李敏)

【摘要】目的利用无菌小鼠建立新疆哈萨克族肥胖儿童菌群人源化(HFA)动物模型，为深入研究哈萨克族儿童肥胖的病理生理机制提供新的研究方式。方法收集新疆哈萨克族7～13岁肥胖儿童新鲜粪便，男女各10例。20只3周龄无菌级C57BL/6J小鼠(雌雄各半)，按照性别进行分组并编号。小鼠灌胃接种哈萨克族肥胖儿童粪便菌悬液0.1 ml/次，隔日一次，共接种3次，且接种时遵循性别一致原则。于接种后第7天收集小鼠新鲜粪便标本，提取基因组DNA后，采用特异性引物对16S rRNA V3区进行PCR扩增，对扩增产物运用DGGE方法分离并鉴定，以了解HFA动物模型中肠道菌群的定植情况。结果接种哈萨克族肥胖儿童肠道菌群后的无菌小鼠盲肠均减小为正常小鼠大小；HFA动物模型的PCR-DGGE指纹图谱显示各观察标本均形成复杂而多样的菌属条带。结论本实验成功利用无菌C57BL/6J小鼠建立哈萨克族肥胖儿童HFA动物模型，该动物模型是探索哈萨克族儿童特征性肥胖与肠道菌群关系的新的选择方式。

【关键词】肥胖症；儿童；哈萨克族；模型，动物 ；菌群人源化动物；无菌小鼠

刘新彩，徐佩茹，李敏，等.新疆哈萨克族肥胖儿童菌群人源化动物模型的建立[J].中国全科医学，2016，19(8)：936-940.[www.chinagp.net]

Liu XC，Xu PR，Li M，et al.Establishment of human flora-associated animal model for obese children of Xinjiang Kazakh nationality[J].Chinese General Practice，2016，19(8)：936-940.

近年来，肥胖现象在全世界快速蔓延，并呈低龄化趋势[1]。肥胖是引起糖尿病、心脑血管疾病等的重要危险因素[2]，肥胖儿童感染性疾病和变态反应性疾病的患病率和病死率均远高于正常儿童。新疆地区学龄儿童流行病学调查显示，哈萨克族儿童肥胖患病率远高于维、汉、回等民族，并高于同期国内学龄儿童平均肥胖患病率[3-4]。因此，在哈萨克族儿童人群中实施早预防、早发现和早诊断肥胖症的策略和措施至关重要。

研究显示，肠道主要菌群比例失衡在哈萨克族儿童肥胖发生中发挥重要作用[5-6]，为探索其作用机制，建立相应的动物模型成为重要手段之一。无菌动物作为微生物背景最清晰的动物，是研究肠道菌群最有效的动物模型之一[7-8]。本研究旨在通过建立菌群人源化(HFA)动物模型，模拟哈萨克族儿童肥胖的特征性肠道菌群环境，为研究哈萨克族儿童肥胖提供新的选择方式。

1材料与方法

1.1粪便采集根据2004年由国际生命科学学会中国肥胖问题工作组领导制定的《中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查体重指数值分类标准》[9]，以年龄、性别、体质指数(BMI)指标为基础，于2014年9—12月选取新疆乌鲁木齐市周边地区7～13岁哈萨克族肥胖儿童20例，男、女各10例。纳入儿童排除遗传、药物、内分泌、代谢及中枢神经系统疾病有关的肥胖及肥胖综合征，入组前6个月内未服用抗生素，家属均签署知情同意书。身高、体质量的测量由儿科临床工作人员实施，仪器均经过校正。脱鞋帽，穿单衣，测立式身高，精确至0.1 cm；体质量精确至0.1 kg。采集肥胖儿童清晨第一次排出的新鲜粪便尾便，无菌、厌氧条件下称量、标记后置于无菌离心管中。迅速保存于-80 ℃冰箱，用前解冻，切忌反复冻融。

1.2实验动物3周龄无菌C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半，购自上海市斯莱克实验动物公司，小鼠按照性别分为两组，随机进行编号，雄性小鼠编号为A1～A10，雌性小鼠为A11～A20。小鼠根据实验动物国家标准(GB-T14926.41-2001)饲养于无菌隔离器(苏州冯氏实验动物设备有限公司)中，环境温度为20～26 ℃，湿度为40%～70%，光照周期明暗比为12 h∶12 h。无菌小鼠的饲料均经40 kGy60Co-γ射线辐照消毒，小鼠自由采食和饮水，饮水、垫料、鼠笼和饮水瓶等均采用高温高压灭菌(121 ℃，60 min)。HFA模型构建前1周取其粪便、毛发、垫料进行微生物检测，确保小鼠体内外均无菌，细菌16S DNA V3区引物PCR检测阴性[10](见图1)。本研究得到本院伦理委员会批准(审批号：IACUC-20140214067)。

图1　无菌小鼠16S DNA V3区细菌检测

1.3方法

1.3.1制备粪便菌悬液配置含10%(vol/vol)三酰甘油的PBS缓冲液(0.05 mol/L，pH=7.4)，121 ℃灭菌30 min，置于厌氧罐中预还原处理24 h。分次解冻已制备的儿童粪便标本，每2 g悬浮于40 ml上述处理过的PBS缓冲液中，稍静置，吸取上清液即为粪便菌悬液。

1.3.2制备HFA小鼠模型小鼠按照性别分装于2个无菌隔离器中，灌胃接种相同性别固定儿童的粪便菌悬液0.1 ml/次，隔日一次，共接种3次。7 d后，收集小鼠新鲜粪便标本，-20 ℃保存备用或直接用于DNA提取。

1.3.3引物设计与合成针对哈萨克族肥胖儿童粪便中的大多数细菌设计和合成特异性引物序列：16S上游引物：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGG-CACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，16S下游引物：5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′，GC夹序列为5′-GCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCC G-3′﹝由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成﹞。扩增产物的片段长度约200 bp。

1.3.4基因组16S rRNA的PCR扩增按硅胶膜-离心柱法从小鼠粪便标本中提取基因组DNA作为PCR的模板，采用上述特异性引物扩增16S rRNA基因的可变V3区。PCR反应体系为60 μl，成分包括10×PCR buffer 6 μl、1.5 mmo/L MgCl2溶液4.8 μl、dNTP 4.8 μl、上下游引物各1.2 μl、模板DNA 2.4 μl、Taq DNA聚合酶4.8 μl，最后加无菌双蒸水补齐至60 μl。采用Perkin Elmer TM 9700型PCR仪进行扩增反应。前20个循环：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火45 s；之后每个循环退火温度下降0.5 ℃，72 ℃延伸1 min。后10个循环：94 ℃变性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；最后一循环72 ℃延伸10 min。

1.3.5PCR扩增产物的DGGE分析采用DcodeTM Universal Mutation Detection System(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)对PCR产物进行质量分数为8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其变性梯度范围为30%～60%，上样量为20 μl的PCR扩增产物。在1×TAE电泳缓冲液中，恒温60 ℃、电压85 V的条件下运行16 h[11]。电泳结束后，用硝酸银染色20 min，去离子水漂洗2次，各10 min，用紫外凝胶成像分析系统观察每个样品的电泳条带并拍照。

1.4建模成功的标准PCR产物运用DGGE方法分离并鉴定，根据电泳条带的多寡和位置初步辨别菌属的种类多少，粗略分析菌群的多样性，从而确定是否建模成功。

2结果

2.1生存状态在接种儿童粪便菌悬液初期，雌性小鼠由于肠道反应，编号为A15、A18、A19的小鼠死亡，余小鼠生存状态良好，无菌隔离器内小鼠总体生存环境良好。

2.2生理解剖无菌C57BL/6J小鼠由于肠道内没有菌群生长，不能正常代谢食物，造成食物残渣滞留于盲肠，故小腹膨胀，解剖见盲肠膨大。HFA小鼠解剖时发现盲肠减小为正常小鼠盲肠大小，由此可知HFA小鼠体内已有菌群定植(见图2、3)。

图2　无菌小鼠的盲肠

2.3PCR-DGGE图谱分析HFA小鼠肠道菌群种类繁多且数量庞大，各标本(死亡小鼠除外)均可观察到清晰的电泳条带，且具有很多共同的条带，说明HFA小鼠存在共有的细菌种属；其共有条带的信号强度强弱不等，说明小鼠共同细菌种属的数量存在差异。DGGE指纹图谱半定量分析条带强度示意图见图4、5。

图4　雄性HFA小鼠的PCR-DGGE图谱

图5　雌性HFA小鼠的PCR-DGGE图谱

3讨论

近年来国内外关于肥胖环境因素的研究显示，肠道菌群与体脂的沉积及肥胖的发生密切相关[12-17]。Backhed等[18]研究提示，肠道微生物能促进单糖的吸收，影响机体能量的吸收、储存。Ley等[19]发现肥胖小鼠拟杆菌门细菌数量显著减少，同时硬壁菌门细菌数量明显增加；肥胖小鼠与非肥胖小鼠的肠道微生物群落的差异可以转移和复制。上述研究均提示个体肠道微生物具有特异性的代谢效能，而微生物所构成的特定特征可能诱发肥胖，肠道菌群比例失衡在动物发生肥胖中发挥一定作用。本课题组前期研究也发现肠道主要菌群比例失衡在哈萨克族儿童的肥胖发生中发挥作用[5-6]。

虽然通过动物研究，肠道菌群对动物发生肥胖的影响已经得到确认，但要清楚阐述人肠道菌群对人类肥胖及肥胖引起的代谢性疾病的影响却很困难。因为在人体内研究肠道菌群时，遗传、环境及饮食等因素对肠道菌群的影响难以控制，人志愿者体内的研究结果往往具有较大的局限性。无菌动物是通过无菌剖宫产手术或无菌胚胎移植进行无菌化获得的动物，利用无菌饲养方法维持于无菌隔离器，且现有方法检测不到活的微生物和寄生虫[20-21]。无菌动物作为微生物背景最清晰的动物，可有效进行菌群、基因及饮食等环境因素控制，是研究肠道菌群对人类疾病及健康影响的最有效动物模型之一。因此，用无菌动物制作的HFA模型可为研究人肠道菌群生态系统及代谢特征提供良好模型[7]。

本研究选用无菌C57BL/6J小鼠灌胃接种单纯性肥胖的哈萨克族学龄儿童的粪便菌悬液，建立哈萨克族肥胖儿童HFA动物模型，且在构建过程中遵循性别一致原则[22-23]，不仅控制了遗传、环境及饮食等影响，而且避免了人体试验的伦理学问题[24]。在研究过程中，从HFA小鼠模型的粪便标本中提取基因组DNA，作为PCR的模板，采用针对哈萨克族肥胖儿童肠道菌群设计和合成的特异性引物[25]，扩增HFA小鼠模型肠道菌群的16S rRNA基因的可变V3区，然后对扩增产物运用DGGE方法分离并鉴定，根据电泳条带的多寡和位置辨别菌属的种类多少，粗略分析HFA小鼠模型中肠道菌群的多样性，同时反映哈萨克族肥胖儿童的肠道菌群在小鼠肠道内的定植情况，从而判定该无菌小鼠是否成功建立哈萨克族肥胖儿童HFA模型。

本研究结果显示，灌胃接种哈萨克族肥胖儿童肠道菌群后的无菌小鼠盲肠减小为正常小鼠盲肠大小，盲肠内几乎无食物残渣，推测哈萨克族肥胖儿童的肠道菌群已定植于无菌小鼠肠道内，参与HFA小鼠的食物代谢。进一步通过HFA小鼠模型的PCR-DGGE指纹图谱显示，除在接种初期由于肠道反应死亡的小鼠外，各HFA小鼠粪便中均可观察到清晰的多条电泳条带，反映了菌属的多样性；各观察标本间具有很多共同的电泳条带，代表其存在共同细菌种属；不同小鼠的共同电泳条带的信号强度并不相同，表示其虽然具有相同的细菌菌属，但菌属数量存在差别。因此，本实验成功在无菌小鼠肠道内模拟哈萨克族肥胖儿童特征性的肠道菌群环境。

PCR-DGGE图谱较好地呈现了哈萨克族肥胖儿童复杂而多样的肠道菌群环境，同时也证明了哈萨克族肥胖儿童的粪便可在无菌C57BL/6J小鼠实现接种，成功构建了哈萨克族肥胖儿童HFA动物模型，为进一步探索哈萨克族儿童肥胖与肠道菌群的关系提供了新的选择，为深入研究哈萨克族儿童肥胖的病理生理机制提供了新的研究方式。

本研究局限性：(1)由于不同细菌细胞壁的构成、rRNA的序列不同，细菌扩增结果也存在差异。因此，PCR-DGGE方法不能保证所有的细菌以相同的效率扩增出来[26]；(2)有菌属不易在无菌小鼠肠道内定植，故个别菌属可能在HFA小鼠模型的粪便中检测不出，电泳条带不能完整显示菌群情况。本课题组将继续致力于新疆哈萨克族儿童肥胖与肠道菌群关系的研究，为进一步探索哈萨克族儿童肥胖的作用机制提供一定的理论基础。

作者贡献：刘新彩进行课题设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；李敏、艾比白·艾尔肯、王红清进行课题实施、评估、资料收集；徐佩茹进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：吴立波)

Establishment of Human Flora-associated Animal Model for Obese Children of Xinjiang Kazakh Nationality

LIUXin-cai，XUPei-ru，LIMin，etal.

DepartmentofPediatrics，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China

【Abstract】ObjectiveTo establish human flora associated (HFA) animal models related with Kazakh obese children in Xinjiang based on germ-free (GF) mice and to provide a new way for the further study of the physiopathologic mechanism of obese children of Kazakh nationality.MethodsWe collected fresh feces from 20 Xinjiang Kazakh obese children who were 7-13 years old;and each gender 10 cases.We selected 20 three-week-old GF C57BL/6J mice (half male and half female) and assigned them into two groups and numbered them.The mice received gavage inoculation of bacterium suspension once every two days，given three times totally and each time 0.1 ml;the principle of gender consistency was followed.On the 7th day after inoculation，fresh feces samples were collected，and genome and DNA were extracted;specific primers were employed to conduct PCR amplification on V3 region of 16S rRNA;DGGE method was adopted to separate and identify amplification products，in order to understand the engraftment of intestinal flora in HFA animal models.ResultsThe cecums of HFA mice were reduced to the normal size after inoculation;PCR-DGGE fingerprint of HFA mice showed that complex and diverse bacterial genus stripes formed in each sample.ConclusionThe establishment of HFA animals related with Kazakh obese children based on GF C57BL/6J mice was successful.HFA animal model is a new method for the study of the relationship between Kazakh obese children and gut microbiota.

【Key words】Obesity；Child；Kazakh；Models，animal；Human flora-associated animal;Germ free mice

(收稿日期：2015-10-14；修回日期：2015-12-31)

【中图分类号】R 723.14

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.08.015

通信作者：徐佩茹，830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院儿科，新疆维吾尔自治区循证医学研究所；

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460165)；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2014211C056)

E-mail：xupeiru126@126.com