氧化损伤诱导的人晶状体上皮细胞系基因表达谱的差异和表型改变

梅　林，王　嵩，闫　博，杨安钢，赵　晶，严　宏



·实验论著·

氧化损伤诱导的人晶状体上皮细胞系基因表达谱的差异和表型改变

梅林1，王嵩1，闫博2，杨安钢2，赵晶2，严宏1

Citation:Mei L, Wang S, Yan B,etal. Discrepant gene expression profile and phenotype changes in human lens epithelial cells after oxidative damage.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):822-825

摘要

目的：探讨人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化刺激后基因表达谱的差异以及相应的表型改变。

方法：培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3并给予H2O2刺激。24h后，提取细胞总RNA进行基因表达谱芯片检测，并采用生物信息学数据库DAVID对氧化刺激组相比对照组显著上调的基因进行Gene Ontology(GO)功能富集分析。RT-qPCR对上调的基因进行验证。通过MTT和流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

结果：表达谱芯片结果显示，氧化刺激造成HLEC中367个基因上调，GO分析表明这些基因富集于310个功能类别中，主要包括p53信号通路、细胞凋亡通路、细胞程序性死亡通路等。RT-qPCR结果证实，6个主要参与促凋亡或抗凋亡调节的基因，包括BCL2A1、TP53I3、FAS、ZMAT3、DDB2和BCL2L1，在氧化刺激后表达水平明显上升。MTT实验和流式细胞仪检测结果显示，H2O2刺激后HLEC凋亡逐渐上升，是细胞氧化损伤的主要表现。

结论：氧化刺激可同时诱导HLEC中促凋亡基因和抗凋亡基因表达水平上调，但最终仍然导致了细胞凋亡。

关键词：人晶状体上皮细胞；氧化损伤；表达谱芯片；细胞凋亡

引用：梅林，王嵩，闫博，等.氧化损伤诱导的人晶状体上皮细胞系基因表达谱的差异和表型改变.国际眼科杂志2016;16(5):822-825

0引言

晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LEC)是晶状体抵抗氧化损伤、维持正常生理功能的重要防线。健康的LEC可合成抗氧化物及抗氧化酶，调节晶状体内环境，修复受损细胞及蛋白质等，LEC的生理状态对于保持晶状体透明性至关重要[1-2]。然而，来自外界环境的刺激如紫外线照射、外伤或手术引起的局部炎症以及糖尿病高血糖等都会对LEC造成损害，而其中一个共同途径就是这些有害因素均能造成细胞内活性氧簇分子(reactive oxygen species，ROS)增加，包括H2O2、O2-和·OH。当ROS的累积超出人晶状体上皮细胞(HLEC)的清除能力时，就会引起细胞的氧化损伤，使细胞新陈代谢失常，进而导致白内障形成[3]。既往研究表明，氧化损伤对细胞的影响涉及到细胞的生长、增殖、分化、凋亡等诸多方面，因此研究HLEC经受氧化损伤后最主要的表型变化并探索其阻断策略，对进一步了解白内障发病机制、寻找预防或治愈白内障的治疗方法具有重要意义。

1材料和方法

1.1材料人晶状体上皮细胞系HLE-B3来自中山大学眼科研究中心惠赠。DMEM低糖培养基、胎牛血清(美国HyClone公司)，胰蛋白酶(上海碧云天公司)，Affymetrix Prime View表达谱芯片(美国Affymetrix公司)，Trizol试剂(日本TaKaKa公司)，逆转录试剂盒(德国Qiagen公司)，实时定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒(德国Qiagen公司)，RT-qPCR荧光探针(日本TaKaRa公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)，分光光度计(美国Bio-Rad公司)，实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组人晶状体上皮细胞复苏后培养于6cm皿中，加入4mL含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，内含105U/L青霉素和105g/L链霉素。细胞置于37℃、含体积分数50mL/L CO2恒温培养箱内培养，细胞生长至80%融合状态时，向培养基中加入浓度为70μmol/L H2O2作为氧化损伤组，对照组细胞不予处理。24h后，使用Trizol提取细胞总RNA。

1.2.2表达谱芯片检测总RNA样品经Agilent Bioanalyzer 2100电泳进行质检，合格的RNA样品采用Affymetrix表达谱芯片配套试剂盒，根据标准操作流程对样品RNA中的mRNA进行放大、标记和纯化，获得带有生物素标记的cRNA。杂交时，采用杂交标准流程和配套试剂盒，在滚动杂交炉中45℃，16h滚动杂交，并在洗涤工作站按照标准流程进行芯片的洗涤。采用GeneChip Scanner 3000对芯片结果进行扫描，采用Command Console Software 4.0读取原始数据，采用Gene Spring Software 11.0中的RMA算法对质控合格的数据进行归一化处理[1,4]。

1.2.3 Gene Ontology分析根据表达谱芯片结果，将氧化损伤组相比于对照组表达量比值>2.0者定义为上调差异基因，并采用DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov/)，对差异基因进行Gene Ontology(GO)功能富集分析。应用Fisher精确概率法找出差异基因中，相比整个基因组背景相比，显著富集的基因功能分类。P<0.05的功能分类定义为在差异基因中显著富集。

1.2.4 RT-qPCR检测使用Trizol提取各组细胞总RNA，分光光度计对RNA样品质检并定量。使用逆转录试剂盒，根据操作流程获取cDNA，并进行RT-qPCR检测，反应体系为20.0μL：荧光探针10.0μL、上下游引物各1.0μL、cDNA模板2.0μL、去离子水6.0μL。反应条件：第一步95℃，3min；第二步95℃，10s；第三步55℃，15s；第四步72℃，15s。其中第二步到第四步设40个循环[1]。BCL2A1：上游，5’-GCAGTGTGGTCTCCGAATGTCT-3’；TP53I3：上游，5’-AAGGAAATAACCACCATGTTAGCCGTGCAC-3’[5]；FAS：上游，5’-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3’[6]；ZMAT3：上游，5’-ATGATCCTCTTGCAACACG-3’[7]；DDB2：上游，5’-TCACTTCCAGCACCTCACAC-3’；BCL2L1：上游，5’-GGACAGCATATCAGAGCTTTGAACA-3’[8]；GAPDH作为内参：上游，5’-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3’。所有下游引物均采用RT-qPCR试剂盒中的通用引物。

1.2.5 MTT实验将HLE-B3以5000/孔接种于96孔板，常规培养至80%孔底面积，吸出培养液，加入含70μmol/L H2O2的新配培养液，分别于12、18、24、36h后，进行MTT实验，方法为：每孔加入5mg/mL MTT溶液，培养4h后，吸出废液，每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速摇匀10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值。每个浓度设5个复孔。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡以同样方法对HLE-B3进行H2O2刺激。24h后，收集氧化损伤组和对照组细胞，PBS洗涤后重悬。根据凋亡检测试剂盒的使用说明，对细胞分别进行Annexin V-FITC和PI染色，使用流式细胞仪分选细胞，并分析最终结果。

统计学分析：应用SPSS 18.0统计软件进行处理。计量资料以均值±标准差表示，数据以常氧组与低氧组间相对比值表示，组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1氧化损伤组与对照组的mRNA表达谱差异表达谱芯片中显著上调基因筛选标准：氧化损伤组表达量与对照组表达量比值>2.0。根据这一标准，表达谱芯片结果显示，H2O2刺激诱导氧化损伤共引起367个mRNA表达上调，部分结果见表1。功能富集分析结果显示，上调的基因富集于310个相关分类中，富集值最高的分类为p53信号通路、细胞凋亡通路、细胞程序性死亡通路等(图1)。

2.2表达谱芯片结果验证经RT-qPCR对BCL2A1、TP53I3、FAS、ZMAT3、DDB2、BCL2L1表达水平进行检测，结果见表2。这些数据表明，氧化损伤发生后，此6个基因表达水平相比对照组显著提高(图2)，实验结果与表达谱芯片结果相吻合。

2.3氧化损伤诱导HLEC细胞发生凋亡MTT实验结果表示，HLE-B3细胞经过H2O2刺激后，随着时间延长，细胞凋亡逐渐增加，直至氧化刺激后36h，仅7%细胞存活(图3)。Annexin V-FITC/PI染色后流式细胞仪分析显示，H2O2刺激后24h，存活细胞约占25%，而凋亡细胞比例达到57%，其结果与MTT实验大致相符(图4)。

3讨论

图1实验组相比对照组上调差异基因的聚类分析(氧化损伤在细胞凋亡、程序性死亡通路、细胞活力等310个分类中有最高差异值)。

大量研究表明，ROS是晶状体混浊及白内障发病的罪魁祸首。正常情况下，ROS可以被细胞内的抗氧化系统及时清除，但是当ROS产生增加，或衰老等因素导致细胞抗氧化能力减弱时，ROS就会在体内累积，造成氧化损伤[9]。

表1氧化损伤后显著上调的基因

基因ID英文缩写英文全称上调比值NM_153361IL8Interleukin86.80NM_006516BCL2A1B-celllymphoma2-relatedproteinA15.78NM_018689TP53I3Tumorproteinp53inducibleprotein35.59NM_020768FASFas(TNFreceptorsuperfamily,member6)5.08NM_022470ZMAT3Zincfinger,matrin-type33.48NM_004994MMP9Matrixmetallopeptidase93.20NM_000089LCE1FLatecornifiedenvelope1F3.10NM_001001669SAT1Spermidine/spermineN1-acetyltransferase13.09NM_006252KANK3KNmotifandankyrinrepeatdomains33.05NM_030915DDB2Damage-specificDNAbindingprotein22.95NM_000302RRM2BRibonucleotidereductaseM2B2.92NM_001191BCL2L1B-celllymphoma2-like12.76NM_001025366CASP1Caspase1,apoptosis-relatedcysteinepeptidase2.69NM_000610CD44CD44molecule2.51

图2RT-qPCR验证过氧化氢刺激后所选基因mRNA水平提高bP<0.01vs对照组。

图3氧化刺激后，HLEC存活率随着时间推移逐渐下降。

表2氧化损伤后高表达基因RT-qPCR验证结果

±s

图4过氧化氢处理24h后HLEC的凋亡水平。

本研究利用表达谱芯片对氧化损伤后HLEC基因表达水平的变化进行了检测，结果显示，氧化损伤组367个基因的表达水平相比于对照组明显上调。通过GO分析，我们发现显著上调的差异基因大部分位于细胞凋亡或程序性死亡相关信号通路中。由此推测，凋亡可能是氧化损伤对HLEC的最主要影响。首先，p53信号通路的激活最为显著。p53是目前研究相对明确的抑癌基因，它可以通过阻断细胞周期、加速细胞衰老、诱导细胞凋亡等方式抑制肿瘤细胞的生长和转移[10]。有研究表明，p53相关凋亡通路对调控HLEC凋亡以及白内障的生成具有重要作用[11]。本研究发现，表达水平上调的p53下游基因中，以TP53I3和FAS较为典型。TP53I3是DNA损伤应答(DDR)系统中的一员，当DNA发生轻度损伤时，可激活TP53I3，参与受损DNA的修复。同时，DDR系统会活化p53，一方面可以阻断细胞周期来配合DNA损伤的修复，另一方面p53可以诱导产生更多活化的TP53I3，但这一过程会产生少量ROS。因此当外界刺激造成DNA严重损伤时，就会引起p53极端过表达并激活更多下游基因与TP53I3相互作用，导致ROS累积，最终启动细胞凋亡信号通路，如FAS[12]。FAS是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员之一，也是p53诱导细胞凋亡的下游调控基因，当配体FasL与受体FasR结合后，会通过衔接蛋白活化起始caspase，再经过caspase酶家族的其他成员将信号逐级放大传播，最终启动凋亡程序[13]。由此我们推测，本研究中，当HLEC经历氧化刺激后，TP53I3的高表达一方面代表了DDR系统的激活，另一方面也意味着p53依赖的促凋亡信号通路的启动，而FAS的高表达可能直接导致了细胞的程序性死亡。其次，在诸多促凋亡基因高表达的同时，我们注意到，一些抑制凋亡基因的表达水平也有着明显上升，如ZMAT3、BCL2A1和BCL2L1。其中ZMAT3也是p53的下游基因之一。p53可以诱导ZMAT-3产生一种锌指蛋白，并作用于p53的下游基因如FAS，起到加速其mRNA降解的作用，抑制细胞凋亡[14]。除了ZMAT3、BCL2A1和BCL2L1作为BCL2家族抗凋亡分子中的成员，其高表达可能也对抑制HLEC凋亡起重要作用。线粒体外膜透化并释放细胞色素C是细胞凋亡通路中的重要环节，而这一环节的启动源于BH3-only蛋白(BCL2 homology domain 3-only protein)与线粒体外膜的BAX、BAK受体结合，BCL2家族的抗凋亡分子可以与BH3-only蛋白作用使其失活，或竞争性结合BAX和BAK，从而阻断细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡[15]。由此可见，HLEC氧化损伤后，促凋亡基因与抗凋亡基因均有上调，而二者拮抗的结果将决定细胞的命运。因此，我们对H2O2氧化刺激后细胞的凋亡水平进行了检测。MTT实验表示，细胞经H2O2处理12h时，仍有85%细胞存活，随后存活细胞数量逐渐减少，由此推测细胞的损伤修复和抗凋亡系统在氧化刺激初期可修复部分损伤、抵抗凋亡信号通路。随着时间的推移，由于氧化损伤较为严重，细胞的修复功能无法代偿，于是更多细胞发生凋亡。流式细胞仪分析结果也表示，H2O2后24h，约75%细胞死亡，其中超过70%细胞发生了凋亡，坏死细胞仅占不到30%，说明大多数细胞的死亡源于氧化刺激后凋亡程序的启动。

综上所述，细胞凋亡是HLEC发生氧化损伤后的重要表现，这一过程涉及多个凋亡和抗凋亡信号通路的调节。未来我们将对这些通路中的关键分子进行更为详细的研究，以进一步了解细胞凋亡在白内障发病过程中的作用，并为临床上通过抑制HLEC细胞凋亡以预防或治疗白内障提供理论依据。

参考文献

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Discrepant gene expression profile and phenotype changes in human lens epithelial cells after oxidative damage

Lin Mei1, Song Wang1, Bo Yan2, An-Gang Yang2, Jing Zhao2, Hong Yan1

Foundation item:National Natural Science Foundation of China(No. 81370997)

1Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China;2Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Hong Yan. Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China. yhongb@fmmu.edu.cn

Received：2016-02-22Accepted：2016-04-11

Abstract

•AIM:To explore the discrepant gene expression profiles and the related phenotype changes in human lens epithelial cells(HLEC) after oxidative stimulation.

•METHODS:Human lens epithelial cell line(HLE-B3) were cultured in normal condition or with H2O2for 24h. Total RNA were extracted for gene expression profiling assay and gene ontology analysis was performed for the significantly up-regulated genes using bioinformational database DAVID. The elevated expressions of up-regulated genes in HLEC after oxidative stimulation were confirmed by RT-qPCR. The apoptosis of HLEC induced by oxidative damage was detected using 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometry.

•RESULTS:Gene expression profiling assay demonstrated that 367 genes were up-regulated in HLEC after oxidative stimulation. These genes were enriched in 310 biological processes mainly associated with p53-related signaling pathways, apoptosis, programed cell death and etc. Six genes mainly pro- or anti-apoptotic, including BCL2A1,TP53I3,FAS,ZMAT3,DDB2 and BCL2L1, were confirmed to be up-regulated by oxidative stimulation using RT-qPCR(P<0.05). Results of MTT assay and flow cytometry showed that apoptosis of HLEC gradually appeared after cells were treated with H2O2and became the main consequence of oxidative stimulation.

•CONCLUSION:Oxidative stimulation can induce up-regulation of proapoptotic genes and lead to apoptosis of HLEC, even though antiapoptotic genes can also be promoted.

KEYWORDS:•human lens epithelial cells;oxidative damage;gene expression profile;apoptosis

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.07

收稿日期：2016-02-22 修回日期： 2016-04-11

通讯作者：严宏，主任医师，教授，博士研究生导师，研究方向：白内障、小儿眼病.yhongb@fmmu.edu.cn

作者简介：梅林，在读博士研究生，研究方向：白内障。

基金项目：国家自然科学基金(No.81370997)
作者单位：
1(710038)中国陕西省西安市，第四军医大学唐都医院眼科；
2(710032)中国陕西省西安市，第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室