番茄红素对紫外线诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

孙敬文，郝　静

作者单位：(150060)中国黑龙江省哈尔滨市，中航工业哈尔滨242医院眼科



·实验论著·

番茄红素对紫外线诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

孙敬文，郝静

作者单位：(150060)中国黑龙江省哈尔滨市，中航工业哈尔滨242医院眼科

Citation:Sun JW, Hao J.Protective effect of lycopene for oxidative damage in human lens epithelial cells induced by UV.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):826-828

摘要

目的:探讨番茄红素对紫外线诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化损伤的保护作用及可能机制。

方法:HLEC传代培养，分为阴性对照组、氧化损伤组、番茄红素低剂量组和番茄红素高剂量组，MTT比色法检测细胞存活率，电子显微镜观察细胞形态学改变，DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS变化，分光光度计检测上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。

结果:番茄红素能明显抑制紫外线诱导的细胞活性的下降，减少紫外线所致HLEC内ROS的生成，引起HLEC内SOD和GSH-Px水平的升高及MDA水平的下降。

结论:番茄红素通过提高细胞内SOD和GSH-Px含量，降低细胞内MDA含量，发挥其较强的抗氧化作用，从而为其用于白内障防治提供可靠的实验依据。

关键词：番茄红素；紫外线；晶状体上皮细胞；氧化损伤

引用：孙敬文，郝静.番茄红素对紫外线诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用.国际眼科杂志2016;16(5):826-828

0引言

白内障是导致我国老年人致盲的首要因素，多种因素能够引起晶状体蛋白质变性而形成白内障，其中氧自由基损伤是首位危险因素[1]。研究结果证实，在晶状体发生混浊之前，就已经出现了晶状体组织及细胞的氧化损伤[2]。本实验模拟白内障的发生机制，体外建立紫外线诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化损伤模型，分析不同浓度的番茄红素干预HLEC后细胞活力以及相关因子表达的变化，并进一步探讨其细胞保护机制，为用于防治白内障提供新的实验依据。

1材料和方法

1.1材料人HLEC(ATCC公司)，番茄红素(Sigma公司，纯度为95%)，DMEM培养基，胎牛血清(美国Hyclone公司)，MTT试剂盒(德国Roche公司)，DCFH-DA试剂盒(美国BD公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)活力测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，酶标仪(上海精密科学仪器有限公司)，CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养细胞培养在含10%胎牛血清，100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，将HLEC置于37℃，体积分数5%CO2培养箱内培养，细胞生长至近融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代。

表1番茄红素对HLEC内MDA和SOD及GSH-PX含量的影响

组别MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)阴性对照组55.32±2.4367.62±3.44153.37±4.05氧化损伤组83.53±3.56b41.28±4.84b102.28±4.52b低浓度番茄红素组80.67±3.7551.84±3.40114.18±3.62高浓度番茄红素组57.28±4.32d69.76±3.30d147.74±4.47d

注：bP<0.01vs阴性对照组；dP<0.01vs氧化损伤组。

1.2.2细胞分组共分4组：(1)阴性对照组；(2)氧化损伤组；(3)低浓度番茄红素组：1×10-6mol/L番茄红素孵育24h；(4)高浓度番茄红素组：1×10-4mol/L番茄红素孵育24h。将氧化损伤组及番茄红素组HLEC垂直放置于紫外线光源下方，撤去培养板盖，照射强度为30mJ/cm2，照射30min；将阴性对照组置于同室同条件无紫外线照射下30min，然后进行相关因子检测。电子显微镜观察细胞形态学改变。

1.2.3 MTT检测细胞活力细胞接种于96孔板(细胞密度5×104/L，每孔120μL培养24h使细胞融合约80%～90%，将原培养液吸出，向各孔细胞中加入20μL终浓度为5g/L MTT无血清培养液，培养4h后弃去培养液，加入150μL的DMSO溶液，置摇床摇晃10min后用酶标仪测定492nm的光密度值。

1.2.4荧光显微镜检测细胞内ROS表达HLEC接种于96孔板内，用含10μmol/L DCFH-DA探针的培养液在37℃细胞培养箱内孵育20min，平衡盐溶液冲洗2次后置于荧光显微镜下检测细胞内荧光强度。

1.2.5氧化应激指标检测相应干预后取各组细胞，裂解后1 200g离心15min取上清液，按试剂盒说明书，使用721D分光光度计测定细胞内SOD和GSH-Px及MDA含量。

2结果

2.1番茄红素对HLEC活性的影响氧化损伤组HLEC经氧化损伤处理后，细胞活性明显下降(41.40%±4.54%)，与阴性对照组(99.40%±3.43%)比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)。用不同浓度番茄红素处理后，HLEC活性分别提高到55.34%±4.01%和75.23%±3.97%，与氧化损伤组比较差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.2不同处理因素下HLEC的形态学改变正常HLEC呈长梭形，贴壁生长，胞膜完整，细胞间界限清晰，氧化损伤组细胞体积缩小，呈圆形改变，细胞间可见丝线样物质相连，出现悬浮细胞(提示坏死细胞的出现)。给予不同浓度的番茄红素处理后，细胞形态逐渐得到改善(图2)。

2.3番茄红素对HLEC内ROS含量变化的影响采用DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS变化情况，氧化损伤组与阴性对照组相比，DCF荧光信号明显增强，不同浓度番茄红素干预后，荧光信号强度逐渐减弱(图3)。

图1番茄红素对HLEC活性的影响aP<0.05vs阴性对照组；bP<0.01vs氧化损伤组。

2.4番茄红素对HLEC内MDA和SOD及GSH-PX含量的影响从表1中可知，氧化损伤组HLEC中MDA含量为83.53±3.56nmol/mL，与阴性对照组(55.32±2.43nmol/mL)比明显升高，SOD(41.28±4.84U/mL)及GSH-Px(102.28±4.52U/mL)含量明显下降。给予番茄红素后，随着作用剂量的升高，MDA含量有下降的趋势，番茄红素高剂量组(57.28±4.32nmol/mL)与氧化损伤组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)；同时番茄红素促进了SOD(69.76±3.30U/mL)及GSH-Px(147.74±4.47U/mL)含量的升高，番茄红素高剂量组与氧化损伤组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。

3讨论

已有研究证实，氧化损伤在白内障的发生、发展中起着重要的作用[3-4]。多种原因可引起晶状体内自由基的生成，如自由基的生成率大于其清除率，体内活性氧类物质蓄积，便会引起晶状体蛋白质和脂质过氧化，HLEC受损，长时间的积累性氧化损伤导致细胞凋亡[5-6]。生理状态下，机体抗自由基损伤的酶如SOD和GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的产生和清除处于平衡。因此，清除活性氧和修复氧化损伤被认为是预防和治疗白内障行之有效的方法[7-8]。

番茄红素广泛存在于红色水果与蔬菜中，抗氧化剂是一种重要的不含氧的类胡萝卜素，其中尤以番茄中的含量最高。有报道显示，其清除单线态氧的能力是β-胡萝卜素的2倍，维生素E的100倍[9-10]。番茄红素分子中含有开链不饱和双键的长链结构，具有淬灭单线态氧、清除自由基的能力[11]。国内外大量研究已经证实，番茄红素在预防胸腺癌和前列腺癌、抗动脉粥样硬化、抗老化、保护皮肤、预防和治疗神经系统退行性疾病、抗炎方面有一定作用[12]。但是对于HLEC氧化损伤的保护作用鲜有报道。

图2不同处理因素下晶状体上皮细胞的形态学改变(×100)A：阴性对照组；B：氧化损伤组；C：低浓度番茄红素组；D：高浓度番茄红素组。

图3番茄红素对HLEC内ROS含量变化的影响(×100)A：阴性对照组；B：氧化损伤组；C：低浓度番茄红素组；D：高浓度番茄红素组。

HLEC对氧化应激损伤较为敏感，我们以传代培养的HLEC为研究对象，利用紫外线建立细胞氧化损伤模型，观察番茄红素对该细胞的保护作用。MTT检测结果显示番茄红素能够抑制氧化损伤致HLEC活力的下降，其保护作用呈剂量依赖性；此外，番茄红素还能够有效抑制细胞内ROS的生成；ROS和MDA是氧化应激的主要产物，其水平的高低反映了细胞受自由基损伤和攻击的程度。用番茄红素干预后，HLEC中SOD和GSH-Px活性较氧化损伤组显著升高，MDA含量显著降低，提示番茄红素可能通过提高细胞内SOD和GSH-Px含量，降低细胞内MDA含量发挥其较强的抗氧化作用。

本研究结果提示，番茄红素在白内障防治方面的运用潜力，对紫外线诱导的HLEC的氧化损伤具有一定的抑制作用，抑制效应与药物浓度正相关，希望通过对白内障发病机制更深入的研究，为白内障的临床防治提供新的实验证据。

参考文献

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Protective effect of lycopene for oxidative damage in human lens epithelial cells induced by UV

Jing-Wen Sun，Jing Hao

Department of Ophthalmology, China Aviation Industry 242 Hospital of Harbin, Harbin 150060, Heilongjiang Province, China

Correspondence to:Jing-Wen Sun. Department of Ophthalmology, China Aviation Industry 242 Hospital of Harbin, Harbin 150060, Heilongjiang Province, China. 3051136639@qq.com

Received：2016-01-17Accepted：2016-04-13

Abstract

•AIM:To investigate the protective effect and possible mechanisms of lycopene for oxidative damage induced by ultraviolet in cultured human lens epithelial cells (HLEC).

•METHODS:HLEC was subcultured and divided into negative control group, oxidative injury group, lycopene low dose group and lycopene high dose group. Cell viability was assayed by MTT colorimetric. Cell morphological changes were detected by electron microscope. Reactive oxygen species (ROS) levels were detected with DCFH-DA fluorescent probe. Content of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH) and malondialdehyde (MDA) in supernatants were detected by spectrophotometer.

•RESULTS:Lycopene could obviously inhibited UV-induced decline in cell activity, reduce UV-induced ROS generation within HLEC, cause SOD, GSH-Px levels increased and MDA levels decreased.

•CONCLUSION:Lycopene plays its strong antioxidant role in increasing the intracellular SOD and GSH-Px content levels and decreasing MDA levels, which provide reliable experimental basis for prevent and treatment of cataracts.

KEYWORDS:•lycopene;ultraviolet;human lens epithelial cell;oxidative damage

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.08

收稿日期：2016-01-17 修回日期： 2016-04-13

通讯作者：孙敬文. 3051136639@qq.com

作者简介：孙敬文，硕士，主治医师，研究方向：晶状体病。