利用骨髓间充质干细胞膜片原位构建“三明治”样组织工程牙周膜的实验研究

徐海春，王 伟，徐晓东▲

（1.上海市黄浦区半淞园社区卫生服务中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁医院口腔科, 上海 200336）

基础研究

利用骨髓间充质干细胞膜片原位构建“三明治”样组织工程牙周膜
的实验研究

徐海春1，王 伟2，徐晓东2▲

（1.上海市黄浦区半淞园社区卫生服务中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁医院口腔科, 上海 200336）

目的 探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片与胶原膜构建的“三明治”样结构植入体内后牙周膜的再生情况。方法 制备BMSCs细胞膜片，与胶原膜构建夹层结构复合于牙根表面，植入原位生长，分别于4w和12w取材，利用X片、HE和天狼星红染色观察牙周膜的再生情况。结果 相比单纯胶原膜组和空白对照组，实验组在牙根与牙槽骨间形成了清晰的软组织间隙，且有类Sharpey’s纤维存在，即形成了功能性牙周膜。结论 细胞膜片-胶原膜-细胞膜片的“三明治”样夹层结构可以较好地促进牙周膜再生。

骨髓间充质干细胞；细胞膜片；牙周膜再生

牙周病越来越成为严重威胁人类健康的常见口腔疾病。随着干细胞和组织工程技术的日益成熟，如何利用牙周组织工程方法实现真正意义上的牙周组织修复，已成为近年来研究的热点。牙周膜是围绕牙根并连接牙根和牙槽骨的致密结缔组织，脱离了牙周这种特殊环境，牙周膜既不能发挥正常的功能，也难以实现组织再生。本实验利用双层干细胞膜片与胶原膜三层材料构建组织工程牙周膜，结合牙根与牙槽骨之间的原位植入环境，尝试原位牙周组织再生，为牙周膜的组织工程重建提供一个新的思路。

1 材 料 和 方 法

1.1 材 料

比格犬，雌雄不限（某医学科学院实验动物中心提供）；可吸收医用胶原膜（某生物医学工程研究所）；α-MEM 培养基（Gibco）；PBS缓冲液；2.5g/ L胰酶（ Amresco） ；青链霉素（Gibco）；胎牛血清（Gemini）；抗坏血酸（Amresco）；DMSO、地塞米松、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素（Sigma）；L-谷氨酰胺、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（Sigma）；75%乙醇；酶联仪（BDSL）；倒置显微镜（Nikon）；CO2细胞培养箱（Thermo）；切片机（Leica）；展片机、烤片机（AIHUA）。

1.2 方 法

1.2.1 细胞膜片的制备：无菌条件下抽取比格犬的骨髓约5ml，加入1:1的PBS缓冲液混匀，用比重为1.063的Percoll密度梯度离心法分离犬BMSCs，并在体外进行培养扩增。取第3代犬BMSCs胰酶消化制成细胞悬液，充分离散，调整其细胞密度为1×106，均匀接种于100 mm培养皿，加入10 ml成膜诱导培养液（含50 μg/ml抗坏血酸和10%FBS的α-MEM），每3天换液，孵育10-14天后可见培养皿底部出现白色膜样物质，边缘卷曲，此即为成熟的犬BMSCs细胞膜片，备用。

1.2.2 动物实验：

1.2.2.1 实验分组：选用1岁的健康比格犬3只，体重约12 kg。将每只犬的上、下颌两侧的第一前臼齿，共计12颗牙随机分为空白对照组、单纯胶原膜组和实验组。

1.2.2.2 动物手术过程：

1.2.2.2.1 实验牙拔除：3%戊巴比妥钠30 mg/kg后肢股静脉注射麻醉动物，将其仰卧固定于手术台，常规消毒铺巾，分离牙龈，使用牙挺、牙钳，按照常规拔牙方法，拔除实验牙。

1.2.2.2.2 牙根预处理：磨除牙冠，拔髓针拔除牙髓，根管锉预备根管，生理盐水冲洗根管，移入预冷PBS中，快速转入超净台，无菌PBS反复冲洗，75%酒精棉球消毒牙根面，尖刀片刮除牙周膜，24% EDTA处理根面2 min，PBS冲洗3遍后自然干燥。

1.2.2.2.3 制备复合体：细胞刮刀沿培养皿边缘小心分离膜片，用无菌镊进行提拉、卷曲，剪取适当大小的胶原膜，复合于两层细胞膜片之间，构成“三明治”结构，包裹于牙根表面。

1.2.2.2.4 牙再植手术：无菌条件下，用涡轮机扩大拔牙窝，大小适当，使复合体顺利进入，且不脱落、移位。牙根就位得当，严密缝合牙龈，使牙根不暴露。

术后动物给予青霉素肌肉注射3 d，流质喂饲。

1.2.2.3 动物处死取材及组织学检测：

1.2.2.3.1 取材：术后4 w 和12 w分别处死动物，取犬的上下颌骨，分段切取4 w和12 w的含实验牙段颌骨，固定于4%多聚甲醛中。

1.2.2.3.2 组织学检测：

1.2.2.3.2.1 HE染色：10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，常规脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，制备石蜡切片，常规HE染色

1.2.2.3.2.2 天狼星红染色：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至水后，天青石蓝液染色5-10min，蒸馏水洗，天狼星红饱和苦味酸浓染15-30min，无水乙醇直接分化与脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，在偏振光下观察新生牙周膜中的胶原纤维。

Ⅰ型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维；

Ⅱ型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布；

Ⅲ型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维；Ⅳ型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。

2 结 果

2.1 动物实验大体过程

实验中制备的细胞膜片具有较好的韧性，可以进行提拉、卷曲等（图1A），利于后面实验应用。细胞膜片成熟后与胶原膜复合构建细胞膜片-胶原膜-细胞膜片的“三明治”样结构，细胞膜片可以紧密贴合于牙根表面（图1B）。如图1C可以看到利用常规拔牙技术顺利拔除第一前臼齿，拔出后注意保持牙根的无菌状态。在牙根原位植入的手术中，拔牙窝的预备大小直接影响复合体进入的顺利程度，如图1D就显示了拔牙窝预备过小导致复合体散落的情况，所以这是需要不断提高的操作步骤，也是实验成功的关键所在。

图1 . 动物实验过程

2.2 放射学观察

比格犬于术后12w进行放射学观察，三组X片差异并不明显：空白对照组根周影像模糊、稀疏（图2A）；胶原膜组未见清晰的类似牙周膜影像（图2B）；实验组见愈合较好，类似牙周膜影像基本清晰（图2C）。

图2 . 术后12w X线片

2.3 组织学观察

实验组4w时牙周膜间隙内有大量平行纤维穿行，并见新生毛细血管（图3C），12w时见有斜行的纤维插入牙骨质，似Sharpey’s纤维穿行（图3F）；胶原膜组4w时似有牙周膜间隙形成，不规则纤维结缔组织充填其中（图3B），12w时不规则纤维结缔组织增多，似有少量类牙骨质形成（图3E）；空白对照组4w时不规则纤维结缔组织剥离于牙根表面，只有少量附着（图3A），12w时只有少量不规则纤维结缔组织与牙根存在连结，并未附着于牙根表面，未见牙骨质（图3D）。

图3 . 组织学观察（HE×200）

2.4 天狼星红染色观察

为进一步评价新生组织，本实验进行了天狼星红染色，在偏振光显微镜下观察牙周膜纤维排列。实验组4w时新生牙周膜中有Ⅰ型胶原（红色）和较多Ⅲ型胶原（绿色，图4C），12w时新生牙周膜主要为Ⅰ型胶原（红色），斜行纤维插入牙骨质内，具有Sharpey’s纤维的特征（图4F，图5G）；胶原膜组通过偏振光显微镜观察显示类牙周膜纤维平行排列，不具有Sharpey’s纤维的特征（图4B），12w时同时存在Ⅰ型胶原（红色）和Ⅲ型胶原（绿色，图4E）；空白对照组4w时见剥离状态的纤维存在于牙根与牙槽骨间（图4A），12w时少量纤维平行排列，主要是Ⅰ型胶原（红色，图4D）。

3 讨 论

路[2-4]。

牙周疾病是引起牙周组织缺损，最终导致临床牙齿缺失的常见原因。多年来，人们一直在寻求能有效增加牙周附着、重建牙周组织的治疗方法。牙周骨移植、引导组织再生(guided tissue regeneration,GTR)技术为牙周病治疗和牙周缺损修复带来了希望，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远未达到所期望的目标[1]。而牙周组织工程技术的引入，为牙周组织再生研究提供了新的思

图4 . 天狼星红染色观察（×200）

图5 . 12w实验组再生牙周膜的高倍镜观察（G×400）

BMSCs在合适的牙周微环境和适当的生物刺激因子的作用下可分化为牙骨质细胞和成骨细胞，被认为是牙周组织工程中一种较为理想的种子细胞[5], 且相比牙周膜细胞群具有来源丰富、取材简单等优势[6]，因此本实验选用BMSCs作为种子细胞。传统的将细胞悬液接种于支架材料植入牙周缺损处的方法细胞利用率较低，且会破坏形成的细胞外基质和细胞连接蛋白等[7]，而细胞膜片技术的出现解决了这些问题。但细胞膜片易收缩、卷曲，本实验将支架材料与其复合使用，不仅对细胞膜片起着支持和保护作用，还可为牙周膜的重建提供一定的空间。

生理情况下，牙周再生的过程是成纤维细胞通过合成与降解胶原对牙周膜中的胶原纤维不断改建，成骨细胞和成牙骨质细胞积聚形成牙骨质和牙槽骨，新形成的牙周膜纤维被埋在其中，进而完成对牙周组织的功能性重建[8]。此实验中应用的胶原膜具有良好的力学强度和韧性，生物相容性好，作为组织再生的天然基质可直接参与愈合过程，对创面和血凝块具有良好的保护作用，为其提供一个很好的再生环境。然后将细胞膜片与胶原膜联合应用，互相弥补了不足，可以更好地促进牙周组织重建。另外Flores等[9]曾用不同层次的牙周膜细胞膜片修复裸鼠牙周缺损，发现三层细胞膜片修复效果更为理想。本实验设计成细胞膜片-胶原膜-细胞膜片的“三明治”样夹层结构，间接增加了细胞膜片厚度，使其与牙根表面贴附更为紧密，更利于牙周膜的形成，进一步证明了该方法的先进性和有效性。本实验中使用胶原膜单独植回原位，只是阻挡了上皮细胞下行生长，对牙周组织再生仅仅提供生物诱导作用[10]，通过HE染色可以发现，实验组在牙周膜间隙内有大量斜行纤维，胶原膜组仅见不规则排列的纤维结缔组织，空白对照组中几乎没有或仅观察到少量纤维结缔组织。从放射学观察也发现实验组愈合得最好，有较清晰的牙周膜影像。证明BMSCs细胞膜片夹层结构具有更好的促进牙周膜再生的效果。

实现牙周组织再生的关键是功能性的牙周纤维（Sharpey’s纤维）斜行插入新生的牙骨质。为了更好地观察牙周纤维的走向，本实验利用偏振光显微镜观察天狼星红染色标本，实验组可看到多数胶原纤维斜行插入新生牙骨质，胶原膜组牙周纤维束多平行于牙根表面，空白对照组再生纤维量少且平行于牙根表面。这提示BMSCs细胞膜片夹层结构实现了真正的再生，可以正常行使咀嚼功能。

总之，本实验所使用的细胞膜片技术保持了细胞最佳的生物学活性，与支架联合应用，互相扬长避短，使其具备更好的机械性能，利于移植细胞较好地贴附于牙根表面，能够较好的诱导牙周膜再生。

[1]Needleman IG, Giedrys一Leeper E, Tucker RJ, Worthington HV. Guided tissue regeneration for Peirodontal infra-bony defects. Cochrane Database Syst Rev, 2001(2):CD001724.

[2]Benatti BB, Silvério KG, Casati MZ, Sallum EA, Nociti FH Jr. Physiological features of periodontal regeneration and approaches for periodontal tissue engineering utilizing periodontal ligament cells.J Biosci Bioeng. 2007,103(1):1-6.

[3]Ripamonti U.Recapitulating development: a template for periodontal tissue engineering. Tissue Eng. 2007,13(1):51-71.

[4]Nakahara T, Ide Y.Tooth regeneration: implications for the use of bioengineered organs in first-wave organ replacement.Hum Cell. 2007,20(3):63-70.

[5]Kawaguchi H，Hirachi A，Hasegawa N，etal．Enhancement of periodontal tissue regeneration by transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]．J Periodontol，2004,75（9）:1281-1287.

[6]Hynes K, Menicanin D, Gronthos S, et al. Clinical utility of stem cells for periodontal regeneration. Periodontol 2000,2012, 59(1):203-227.

[7]Fujioka N，Morimoto Y，Takeuchi K，etal. Difference in infrared spectra from cultured cells dependent on cell-harvesting method[J]. Appl Spectrosc，2003，57:241.

[8]彭海艳，牙周引导组织再生技术在牙周病治疗中的应用.当代医学，2015,21（2）：73-74.

[9]Flores MG, Hasegawa M, Yamato M, et al. Cementumperiodontal ligament complex regeneration using the cell sheet technique. J Periodontal Res, 2008,43(3):364-371.

[10]Karring T, Nyman S, Gottlow J,etal.Development of the biological concept of guidedtissue regeneration: animal and human studies. Periodontol 2000,1993, 1(1):26-35.

Periodontal Regeneration on the Surface of Tooth Root Using BMSCs Sheet Combined with a Sandwich Structure：a Canine Model in Situ

XU Haichun1，WANG Wei2，XU Xiaodong2
(1. Department of Stomatolugy,Bansong Community Health Centre of Huangpu District, Shanghai City, 200011,China; 2. Department of Stomatolugy,Shanghai Tongren Hospital, Shanghai City, 200336,China)

Objective To probe the periodontal ligament regeneration effect of implantation of bone marrow mesenchymal cells（BMSCs）sheet -collagen membrane-BMSCs sheet sandwich complex. Methods BMSCs cell sheet-collagen membrane-BMSCs sheet complexes were compounded on the root surface. All dogs were killed on 4 weeks and 12 weeks after implantation. The periodontal ligament regeneration were observed in radiological means ,HE staining and Sirus-red staining. Results Compared with collagen membrane group and blank control group,there was a clearly periodontal ligament like tissue and Sharpey’s like fibres formation only in test group. Conclustion Cell sheet-collagen membrane-cell sheet sandwich complex can preferably improve the periodontal ligament regeneration.

bone marrow mesenchymal stem cell；cell sheet；extracellular matrix；tissue engineering

徐海春（1978-），女，江苏南京人，本科，主治医师。

徐晓东（1974-），男，浙江鄞县人，本科，副主任医师。