HTRA1在中老年人牙周膜组织中的表达及对细胞增殖的作用

陆林杰 卢 怡 (锦州医科大学中国人民解放军第306医院研究生培养基地，北京 100101)

HTRA1在中老年人牙周膜组织中的表达及对细胞增殖的作用

陆林杰 卢 怡 (锦州医科大学中国人民解放军第306医院研究生培养基地，北京 100101)

目的探讨丝氨酸蛋白酶(HTRA)1在中老年人牙周膜组织中的表达及对细胞增殖的作用。方法收集该院口腔颌面外科50岁以上患者的患者前磨牙8颗和第三磨牙4颗，要求牙根结构完整，无明显牙周组织炎症。RT-PCR和免疫组化法分别检测人牙周膜组织中HTRA1 mRNA和蛋白表达情况；组织块法培养原代人牙周膜细胞，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2'5-二苯基四氮唑溴蓝(MTT)法检测增殖情况；慢病毒转染使细胞中HTRA1过表达和基因沉默，以空载体为对照，使用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)检测HTRA1对人牙周膜细胞增殖的影响。结果RT-PCR显示HTRA1 mRNA在牙周膜组织中呈阳性表达；免疫组化染色显示，HTRA1在牙周组织中呈阳性表达，主要表达于牙周膜细胞和细胞外基质中。人牙周膜细胞经体外培养后生长曲线符合该细胞的生长特征。慢病毒转染成功干预HTRA1基因表达后，在培养1、3、5、7、9 d时，过表达组牙周膜细胞增殖速度明显低于过表达空载体对照组，基因沉默组牙周膜细胞增殖速度明显高于基因沉默空载体对照组(P<0.05)。结论HTRA1 mRNA及蛋白均表达于中老年人牙周膜组织中，并对牙周膜细胞增殖起到明显调节作用。

丝氨酸蛋白酶1；牙周膜；细胞增殖

随着年龄的增长，牙周膜中胶原纤维增多，细胞成分减少，厚度变薄，易引发牙周病，是中老年人失牙的主要原因之一〔1〕。丝氨酸蛋白酶(HTRA)广泛存在于人体多个组织中，参与细胞增殖、凋亡、炎性反应等生理和疾病过程，其中HTRA1是重要的矿化调节因子，与关节炎、血管钙化等病理性矿化存在明显关联〔2〕。目前HTRA1在人牙周膜中的生物学作用尚未明确。相关研究发现，HTRA1在人牙周膜细胞成骨分化中起到重要调节作用〔3〕，本研究拟探讨HTRA1在中老年人牙周膜组织中的表达及对牙周膜细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清(美国Sigma)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)细胞增殖试剂盒、cDNA合成试剂盒(北京赛驰生物科技有限公司)；兔抗人HTRA1多克隆抗体(上海领成生物科技有限公司)；细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)(北京利维宁生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与鉴定 收集锦州医科大学中国人民解放军第306医院口腔颌面外科拔除的50岁以上患者的前磨牙4颗，牙根结构完整，无明显牙周组织炎症。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后刮取牙根部1/3的牙周膜组织，放入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃ CO2孵箱中培养。牙周膜细胞约90%汇合后进行传代，每3 d换1次细胞培养液。免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源，选4～6代细胞进行实验。

1.2.2标本收集和苏木素-伊红(HE)染色 收集该院口腔颌面外科拔除的50岁以上第三磨牙4颗，无明显牙周炎症。冲洗后用4%多聚甲醛溶液固定48 h，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，常规脱水、透明、石蜡包埋，5 μm连续切片备用。取部分切片进行常规HE染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.2.3RT-PCR检测 收集与上述要求相同的4颗前磨牙，刮取牙根部1/3的牙周膜组织，研碎后用Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，反应体系为20 μl，常规反应条件下共进行40个循环，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。电泳分析PCR扩增产物。

1.2.4免疫组化染色 取部分切片脱蜡后在3% H2O237℃下孵育45 min，PBS冲洗后血清封闭30 min，加兔抗人HTRA1多克隆抗体(1∶100)，4℃孵育过夜，PBS代替一抗作阴性对照；37℃孵育30 min后加二抗，37℃孵育20 min，冲洗后加辣根过氧化物酶(HRP)标记的工作液，二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木精复染、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.2.5人牙周膜细胞增殖情况检测 采用MTT法进行检测，将第3代人牙周膜细胞按1×103个/孔的密度接种到96孔板，培养第1、3、5、7、9、11、14天时，每孔分别加入MTT溶液20 μl，终浓度为5 mg/ml，孵育4 h后终止反应，弃去上清后每孔加150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡20 min后放入酶标仪，在490 nm波长处读取各孔的吸光度值，以培养第1天吸光度值为对照数据。

1.2.6慢病毒感染人牙周膜细胞 使用HTRA1过表达慢病毒载体和shHTRA1慢病毒载体感染人牙周膜细胞，成功得到HTRA1过表达人牙周膜细胞(过表达组)和基因沉默的人牙周膜细胞(基因沉默组)；用空载体慢病毒感染的人牙周膜细胞为空白对照组，分别为过表达空载体对照组(NC1组)和基因沉默空载体对照组(NC2组)；不加慢病毒的细胞为阴性对照组。观察培养1、3、5、7、9 d时HTRA1基因对人牙周膜细胞增殖的影响。

1.2.7慢病毒感染后细胞增殖情况检测 将过表达组和NC1组、基因沉默组和NC2组人牙周膜细胞用胰酶消化后按5×103个/孔的密度接种到96孔板，培养第1、3、5、7、9天时用PBS洗涤3次，按试剂盒说明100 μl/孔加入CCK8工作液，孵育4 h，在450 nm波长处读取吸光度值。

1.3统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1HTRA1在牙周膜组织中的蛋白及mRNA表达 RT-PCR显示，HTRA1 mRNA在牙周膜组织中呈阳性表达。免疫组化染色显示，HTRA1在牙周膜组织中的牙周膜细胞、血管内皮细胞、基质中均呈阳性表达，主要表达于牙周膜细胞和细胞外基质中，见图1。

2.2牙周膜细胞增殖情况 MTT法检测显示，牙周膜细胞培养1～3 d生长相对缓慢，第1、3天的吸光度值分别为：0.181±0.057、0.208±0.060；3 d后增殖速度明显增加并持续到第9天，第5、7、9天吸光度值分别为0.428±0.093、0.581±0.072、0.814±0.052；9～14 d增殖速度明显减缓并逐渐进入平台期，第11、14天吸光度值分别为0.782±0.115、0.837±0.160，符合细胞生长潜伏期、对数生长期、平台期3个阶段。

2.3慢病毒感染牙周膜细胞情况 慢病毒感染96 h后观察绿色荧光蛋白表达，确定转染效率。荧光显微镜下可见NC1和NC2组均存在明显的绿色荧光蛋白表达，而阴性对照组未见绿色荧光(见图2)。说明慢病毒成功转染牙周膜细胞。

图1 HTRA1在牙周膜组织中的蛋白表达(×400)

2.4HTRA1基因对牙周膜细胞增殖的影响 培养1、3、5、7、9 d时过表达组牙周膜细胞增殖的吸光度值分别为：0.905±0.094、1.642±0.049、1.122±0.057、1.118±0.041、1.116±0.031；NC1组分别为：1.060±0.064、1.913±0.097、1.953±0.268、1.294±0.157、1.250±0.113；基因沉默组分别为：0.531±

0.055、0.984±0.067、1.637±0.113、2.355±0.183、2.566±0.197；NC2组分别为：0.418±0.026、0.820±0.034、1.178±0.073、1.624±0.082、1.823±0.091。过表达组牙周膜细胞增殖速度明显低于NC1组，差异有统计学意义(P<0.05)；基因沉默组周膜细胞增殖速度明显高于NC2组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 慢病毒感染牙周膜细胞96 h后荧光蛋白表达情况(×400)

3 讨 论

人牙周膜成纤维细胞是牙周组织修复、再生的基础，HTRA1在不同组织中的表达具有特异性，与多种病理生理过程有关。已有研究发现，人牙周膜细胞中存在HTRA1表达〔4〕，但其在人牙周膜组织中的生物学作用仍未明确。HTRA1存在于体内多个正常组织中〔5〕，本研究结果提示，HTRA1在人牙周膜组织中可能发挥生物学作用。进一步分析结果显示，高表达HTRA1后可明显抑制人牙周膜细胞增殖，基因沉默后可显著促进牙周膜细胞增殖。相关研究显示，HTRA1可明显抑制多种细胞的增殖和迁移，当其低表达时可起到促进作用，如影响卵巢癌细胞、黑色素瘤细胞、视网膜内皮细胞等〔6〕。本研究有研究显示，HTRA1基因可正向促进人牙周膜细胞成骨分化〔5〕。因此推测HTRA1基因可通过抑制牙周膜细胞增殖来促进向成骨细胞分化，但确切机制仍需进一步研究。

1罗爱华,谢 红,岳朝晖,等.中老年牙周病流行趋势现状及其相关危险因素〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(17):4334-5.

2Supan JI,Shimomachi M,Hasan M,etal.HtrA1 is induced by oxidative stress and enhances cell senescence through p38 MAPK pathway〔J〕.Exp Eye Res,2013;112(5):79-92.

3Li R,Zhang Q.HtrA1 may regulate the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells by TGF-β1〔J〕.J Mol Histol,2015;46(2):137-44.

4廖雪峰.盐酸米诺环素软膏联合甲硝唑缓释药膜治疗慢性牙周炎的疗效观察〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2014;15(2):229-32.

5Wang G,Dubovy SR,Kovach JL,etal.Variants at chromosome 10q26 locus and the expression of HTRA1 in the retina〔J〕.Exp Eye Res,2013;112:102-5.

6Mullany SA,Moslemi-Kebria M,Rattan R,etal.Expression and functional significance of HtrA1 loss in endometrial cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2011;17(3):427-36.

R781.4

A

1005-9202(2017)24-6031-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.012

北京市科委首都市民健康项目(No.Z151100003915091)

卢 怡(1971-)，女，硕士，副教授，副主任医师，主要从事牙科学研究。

陆林杰(1985-)，男，硕士，医师，主要从事牙科学研究。

〔2017-05-23修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)