化浊润燥降气方对食管癌前病变模型小鼠NDRG1蛋白和基因表达的影响

范焕芳 单保恩 黄 茂 王 玲 韩长辉 (河北省中医院肿瘤二科，河北 石家庄 0500)

化浊润燥降气方对食管癌前病变模型小鼠NDRG1蛋白和基因表达的影响

范焕芳 单保恩1黄 茂2王 玲1韩长辉3(河北省中医院肿瘤二科，河北 石家庄 050011)

目的观察化浊润燥降气方对小鼠食管癌前病变组织分化相关基因NDRG1蛋白及基因表达的影响。方法将130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组(预防组)、中药治疗组(治疗组)，采用4-硝基喹啉-氧化物(4-NQO)制备小鼠食管癌前病变模型，采用Western印迹、RT-PCR方法观察各组食管组织中NDRG1蛋白及基因表达。结果14 w末食管癌前病变模型成功，24 w末实验结束。24 w末模型组小鼠NDRG1蛋白及基因表达水平与正常组相比明显升高(P<0.05)；阳性对照组、预防组、治疗组分别与模型组相比明显降低(P<0.05)；预防组、治疗组明显高于阳性对照组(P<0.05)；预防组较治疗组明显降低(P<0.05)。结论4-NQO是制备小鼠食管癌前病变模型的有效药物。化浊润燥降气方能减少食管组织NDRG1蛋白及基因的表达，延缓小鼠食管癌前病变到食管癌的进程，中药预防用药更具一定优势。

食管癌前病变；化浊润燥降气方；4-硝基喹啉一氧化物；NDRG1

研究表明，分化相关基因NDRG1参与细胞的生长、发育及胚胎发育，抑制肿瘤细胞的生长和侵袭转移，是影响恶性肿瘤预后的新指标〔1，2〕。NDRG1与食管肿瘤细胞的分化有关〔3〕。本实验通过建立小鼠食管鳞状上皮癌前病变动物模型，选取具有化浊解毒、润燥降气作用的免煎中药颗粒化浊润燥降气方作为研究对象，采用Western印迹、RT-PCR方法，观察模型小鼠食管组织NDRG1的表达及化浊润燥降气方的干预作用。

1 材料与方法

1.1动物 选取清洁级健康SPF级C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周龄，体重17～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2药物 造模药物4-硝基喹啉一氧化物(4-NQO)(购自Sigma公司)：将1 g 4-NQO溶于50 ml蒸馏水，配成浓度为2%的稀释液，4℃冰箱避光保存。使用时取0.5 ml 2%原液加入100 ml饮用水中，配成100 μg/ml浓度。每100 g小鼠每日用4-NQO 2 500 μg，即口服25 ml含有4-NQO的饮用水。阳性对照药物ATRA(购自Sigma 公司)：使用时将30 mg ATRA 溶于20 ml稀释后的甲基纤维素中，每20 g小鼠每次灌胃剂量为0.15 mg，每周3次。化浊润燥降气方：中药免煎颗粒化浊润燥降气方(药物组成：丹参、沙参、郁金、砂仁、荷叶、茯苓、浙贝母、藿香、佩兰、冬凌草、全蝎)。由河北省中医院药学部提供，每付中药生药含量131 g，免煎颗粒为13.7 g，小鼠用量与人用量的比例为0.002 6∶1(即成人70 kg的用量乘以系数0.002 6就是20 g小鼠的灌胃量)，每20 g小鼠服用0.2 ml含有中药的水溶液。

1.3主要试剂 山羊抗NDRG1多克隆抗体(美国SANTA CRUZ生物公司)；蛋白浓度检测试剂盒(南京建成生物技术公司)；蛋白印迹PVDF膜(美国Milipore公司)；蛋白质Marker(美国PIERCE公司产品)；PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)；RT-PCR二步法试剂盒(美国Promega公司)。

1.4动物喂养 将130只小鼠于恒温18℃～25℃、湿度保持为30%～50%环境中，用经高压灭菌的清洁级动物饲料和水适应性喂养3 d，开始实验。

1.5分组及模型制备 采用随机分组的方法将130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组(预防组)、中药治疗组(治疗组)，正常组、阳性对照组各20只，其余每组30只。各组雌雄小鼠数无明显差异，雌雄分笼。正常组常规饲养，不做特殊处理。其余110只小鼠，每日饮用100 μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂养饲料。预防组在开始造模同时给予化浊润燥降气方灌胃，每周3次，剂量为20 g小鼠服用0.2 ml浓缩中药免煎颗粒。各组小鼠在给药期间每周测体重一次，根据体重调整给药剂量。14 w末癌前病变模型成功。小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型组常规饲养；阳性对照组小鼠开始给予ATRA，剂量为每20 g每次灌胃剂量为0.15 mg，每周3次；预防组小鼠继续给予化浊润燥降气方灌胃，剂量如前；治疗组小鼠在模型制备成功时开始给予化浊润燥降气方灌胃，用量同预防组。24 w末模型组5只小鼠食管上皮均有癌变，遂全部处死小鼠，取食管标本，进行各组指标检测。

1.6Western印迹法检测NDRG1蛋白表达 从食管上皮组织提取蛋白，测定总蛋白含量，配制12%SDS-PAGE分离胶，进行电泳，转膜，封闭。将蛋白印迹PVDF膜放入1∶200稀释的一抗(山羊抗NDRG1、GAPDH多克隆抗体)，4℃反应过夜。PVDF膜于TTBS振荡冲洗3遍。加入用TTBS 1∶5 000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，室温孵育1 h。二氨基联苯胺(DAB)显色，用数码相机照相并保存结果，结果应用Quantity one软件进行分析，计算目的蛋白与GAPDH的光密度比值。

1.7RT-PCR法检测NDRG1 mRNA表达 提取总RNA，逆转录合成cDNA，用FOTODYNE凝胶成像分析系统观察结果，显示出清晰的28S和18S两条rRNA带，且28S与18S的亮度比与宽度比接近2∶1，提示RNA完整性好。NDRG1 mRNA引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其上游引物序列为5′-GTCCCGAGAGCTACATGACG-3′；下游引物序列为5′-AGCACGAGACCCTCTACCAT-3′，扩增基因片段长度483 bp。以GAPDH作为内参。GAPDH上游引物序列为5′-CTCTGCTCCTCCCTGTTCCAG-3′；下游引物序列为5′-TGATGTTAGTGGGGTCTCGC-3 ′。扩增基因片段长度为319 bp。以cDNA为模板，在1.5 ml的离心管中加入上下游引物、cDNA、 Taq 10倍缓冲液、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶，建立NDRG1和 GAPDH的PCR反应体系，将反应管置于PCR扩增仪中，循环反应程序为：94℃3 min预变性，然后94℃变性40 s，退火55℃50 s，延长72℃90 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min，使反应更彻底。取每个标本的扩增产物6 μl于1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准片段标记，电泳后于紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机应用Quantity One凝胶图像分析软件对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，各组NDRG1 mRNA表达用目的基因扩增片段的积分吸光度与GAPDH扩增片段的积分吸光度的比值表示。

1.8统计学方法 用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，方差齐时用SNK-q检验作两两比较。

2 结 果

2.1各组小鼠上皮组织NDRG1蛋白表达 正常组NDRG1表达水平为0.400±0.055，模型组为0.845±0.088，模型组较正常组明显升高(P<0.05)；阳性对照组、预防组、治疗组NDRG1蛋白表达水平分别为0.493±0.021；0.549±0.033；0.649±0.023，三组均较模型组明显降低(P<0.05)；预防组、治疗组明显高于阳性对照组(P<0.05)，预防组较治疗组明显降低(P<0.05)。见图1。

2.2各组小鼠上皮组织 NDRG1 mRNA表达变化 正常组小鼠食管上皮组织中NDRG1 mRNA表达为0.313±0.017，明显低于模型组(0.720±0.019，P<0.05)；阳性对照组、预防组、治疗组NDRG1 mRNA分别为0.372±0.025；0.440±0.019；0.474±0.031，均较模型组明显降低(P<0.05)；预防组、治疗组明显高于阳性对照组(P<0.05)，预防组较治疗组明显降低(P<0.05)。见图2。

A～E：正常组、模型组、阳性对照组、预防组、治疗组，下图同图1 各组小鼠上皮组织NDRG1蛋白表达

图2 各组小鼠上皮组织NDRG1 mRNA表达

3 讨 论

研究表明，NDRG1主要存在于细胞质和细胞膜，极少量存在于细胞核〔4〕，主要表达于前列腺、卵巢、结肠及肾脏中，与宫颈癌的发生也密切相关〔5，6〕。 贺付成等〔3〕对NDRG1 mRNA和蛋白在食管癌组织中的表达进行研究，结果表明，在正常食管黏膜组织中NDRG1蛋白呈强阳性表达，而在癌旁不典型增生及食管鳞癌组织中NDRG1蛋白呈弱阳性或不表达。张蕾等〔7〕采用不同浓度的诱导分化剂佛波酯、维甲酸、丁酸钠和维生素D3分别作用于食管癌EC9706 细胞，进行体外及体内实验，观察诱导分化剂对食管癌细胞NDRG1 mRNA及蛋白表达的影响，结果表明以上诱导分化剂可明显上调食管癌细胞NDRG1 mRNA及蛋白的表达水平。纪晓花等〔8〕研究表明，连花参加方可以抑制食管癌前病变小鼠β-catenin蛋白的聚积，推测这可能是抑制小鼠食管癌变发生与发展的机制之一。食管癌前病变属噎膈范畴，为噎膈早期病证〔9〕。启膈散，出自清代医家程钟龄(国彭)所著之《医学心悟》一书，是为治疗“噎膈”所设。化浊润燥降气方是在名方启膈散的基础上加化浊通络解毒之品藿香、 佩兰、冬凌草、天龙、全蝎而成。藿香、佩兰与砂仁合用，芳香化浊，消湿浊；冬凌草甘凉，入肺、胃经，具有清热解毒之效；天龙、全蝎攻毒散结，通络止痛，与启膈散合用，全方共奏化浊解毒、化痰解郁、通络散结之效。本研究表明，食管癌前病变小鼠食管组织中存在NDRG1的高表达，随着食管癌前病变向食管癌发展，NDRG1的表达升高，化浊润燥降气方能减少食管癌前病变小鼠食管组织NDRG1蛋白和基因表达，预防用药在抑制NDRG1蛋白和基因表达方面具有一定优势。

1常晓静，戴冬秋.分化相关基因NDRG1的研究进展〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2010；17(11)：873-6.

2史 杪，陈晓东.N-myc 分化相关基因1与癌症的关系〔J〕.包头医学院学报，2013；29(3)：113-5.

3贺付成，张 岚，高冬玲，等.食管癌组织中NDRG1 mRNA和蛋白的表达〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2006；41(3)：395.

4高曰文，朱耀明，朱晨宇.分化相关基因NDRG1在消化系统肿瘤中的研究进展〔J〕.广东医学，2010；31(23)：3136-8.

5Liu W，Xing F，Iiizumi-Gairani M，etal.N-myc downstream regulated gene 1 modulates Wnt β-catenin signalling and pleiotropically suppresses metastasis〔J〕.EMBO Mol Med，2012；4(2)：93-108.

6陈苗苗，吴 均，朱雪琼.细胞分化相关基因在宫颈癌中的研究进展〔J〕.医学研究杂志,2013；42(11)：165-8.

7张 蕾，贺付成，张云汉.食管鳞癌组织中分化相关基因NDRG1的表达及肿瘤诱导分化治疗的研究进展〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2009；44(5)：933-51.

8纪晓花，王 玲，单保恩，等.连花参加方对小鼠食管癌前病变组织中β-catenin蛋白表达的影响〔J〕.肿瘤，2015；35：528-35.

9霍炳杰，徐江红，邢筱华.刘亚娴教授治疗食管癌前病变经验〔J〕.河北中医，2011；33(4)：488-9.

R735.1

A

1005-9202(2017)24-6027-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.010

河北省高层次人才资助项目(No.B2012003007)

1 河北医科大学第四医院科研中心

2 河北省中医院儿科 3 河北医科大学研究生学院

单保恩(1962-)，男，教授，博士生导师，主要从事恶性肿瘤基础及临床研究。

范焕芳(1970-)，女，主任医师，医学博士，硕士生导师，主要从事恶性肿瘤临床及基础研究。

〔2016-12-16修回〕

(编辑 曹梦园)