LINC00963靶向miR-525-5p调控LPS诱导的牙周膜细胞损伤的机制研究

喻茂文 柳建磊 汤洪波 陈建军 莫邦竹

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)通过调节微小RNA(MicroRNA，miRNA)在牙周炎的发展中发挥调节作用[2-3]。LINC00963是一种在癌症病理进展中具有重要作用的lncRNA[4]，被认为是细胞凋亡的调节因子。研究表明，LINC00963在急性肾损伤小鼠和细胞模型中高表达，敲低其表达可靶向miR-128-3p减轻急性肾损伤[5]。LINC00963在慢性肾衰竭小鼠模型中高表达，干扰其表达可抑制慢性肾衰竭造成的氧化应激[6]。MiR-525-5p在心肌梗死中下调表达[7]。miR-525-5p在脑缺血再灌注损伤中下调表达，敲低其表达可诱导细胞凋亡，增加脑梗死面积[8]。可见LINC00963和miR-525-5p可以影响细胞损伤过程，但二者在酯多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的牙周膜细胞损伤中的表达及其对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的影响尚未可知。本研究构建了LPS刺激的人牙周膜细胞作为细胞模型，考察LINC00963和miR-525-5p对此模型中细胞凋亡和炎症因子表达的影响，并进行LINC00963的机制探索。

1 材料与方法

1.1 材料

LipofectamineTM2000、增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂底物(Invitrogen,美国); PrimeScript RT试剂盒、SYBR Master Mix试剂盒(Takara,日本); miScript Reverse Transcription试剂盒、miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，德国)； si-NC、si-LINC00963、miR-NC、miR-525-5p、anti-miR-NC、anti-miR-525-5p(上海GenePharma)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(南京KeyGen)； TNF-α和IL-1βELISA试剂盒(Abcam,美国)。

1.2 细胞分离培养

收集在本院进行正畸的健康志愿者离体牙，研究获得参与者的知情同意，经医院伦理批准通过。将牙周膜组织从牙根表面轻轻刮下，根据先前的报道[9]分离人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells， hPDLCs)，将其接种到含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中生长，并保持在5% CO2和37 ℃的环境。

1.3 细胞处理与分组

取第2～3 代牙周膜细胞分为Con组(对照)、LPS组(10 μg/mL LPS诱导牙周膜细胞24 h)、LPS+si-NC组(LPS+转染si-NC)、LPS+si-LINC00963组(LPS+转染si-LINC00963)、LPS+miR-NC组(LPS+转染miR-NC)、LPS+miR-525-5p组(LPS+转染miR-525-5p)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC组(LPS+转染si-LINC00963+anti-miR-NC)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p组(LPS+转染si-LINC00963+anti-miR-525-5p)。根据制造商Invitrogen的操作规程，当牙周膜细胞达到70%～80%融合时，使用LipofectamineTM2000进行转染。转染24 h后，进行10 μg/mL LPS诱导，持续24 h。

1.4 RT-qPCR检测LINC00963和miR-525-5p表达

将Con组、LPS组和各实验组中的牙周膜细胞加入Trizol试剂提取总RNA。检测LINC00963表达时，根据说明，使用PrimeScript RT试剂盒用10 μL逆转录系统将总RNA逆转录为cDNA。qPCR实验是使用SYBR Master Mix试剂盒在ABI 7900HT定量PCR系统进行的。检测miR-525-5p表达时，根据说明，使用miScript Reverse Transcription试剂盒制备cDNA，miScript SYBR Green PCR试剂盒进行qPCR。将GAPDH和U6用作内参，采用2-ΔΔCt法计算LINC00963和miR-525-5p水平。引物如下(5′-3′)：LINC00963 F：GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT，R：ACGTGGATGACAGCGTGTGA。GAPDH F：AGTCCACTGGCGTCTTCA，R：GAG-TCCTTCCACGATACCAA。miR-525-5p F：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG，R：GCGAGCACAGAATTAATAC-GACTCAC。U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACG-CTTCACGAATTTGCGT。

1.5 ELISA检测炎症因子TNF-α和IL-1β水平

使用ELISA试剂盒测定Con组、LPS组和各实验组中的牙周膜细胞上清液中TNF-α和IL-1β水平。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒于流式细胞仪分析不同组的牙周膜细胞凋亡率(%)。

1.7 Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)表达

将Con组、LPS组和各实验组中牙周膜细胞于RIPA裂解缓冲液在冰上反应30 min。使用Bio-Rad电泳仪，SDS-PAGE(10%凝胶)分析含有20 μg总蛋白的样品，并转膜。将膜与抗Bcl-2、Bax和GAPDH(对照)抗体(均为1∶1 000)在4 ℃过夜，并与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶二抗在室温下孵育1 h。随后将膜与ECL溶液孵育进行成像分析。

1.8 双荧光素酶报告实验

构建含有miR-525-5p结合位点的LINC00963野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告质粒，命名为WT-LINC00963和MUT-LINC00963。随后，将两个质粒分别与miR-NC或miR-525-5p共转染到牙周膜细胞中，转染48 h后收集细胞，利用双荧光素酶报告检测系统检测相关荧光素酶活性。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 LINC00963和miR-525-5p在LPS诱导的牙周膜细胞损伤中的表达

LPS诱导牙周膜细胞后，LPS组LINC00963表达水平约为Con组的2.74 倍，miR-525-5p表达水平约为Con组的0.35倍(P<0.05)(图 1)。

图 1 LINC00963和miR-525-5p在LPS诱导的牙周膜细胞损伤中的表达

2.2 干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞炎症因子表达的影响

LPS组牙周膜细胞中LINC00963表达水平、TNF-α和IL-1β水平分别比Con组增加了约1.88、1.80和2.33 倍(P<0.05)，干扰LINC00963表达后，LPS+si-LINC00963组牙周膜细胞中LINC00963表达水平、TNF-α和IL-1β水平比LPS+si-NC组减少了约0.47、 0.57和0.48 倍(P<0.05)(图 2)。

图 2 干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞炎症因子表达的影响

2.3 干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞凋亡的影响

LPS组牙周膜细胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平分别是Con组的约3.68、0.39和4.83 倍(P<0.05)，干扰LINC00963表达后，LPS+si-LINC00963组牙周膜细胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平是LPS+si-NC 组的约0.41、2.5和0.34 倍(P<0.05)(图 3)。

图 3 干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞凋亡的影响

2.4 LINC00963靶向调控miR-525-5p的表达

StarBase软件对LINC00963与miR-525-5p靶向结合位点预测结果见图 4A。 miR-NC组WT-LINC00963和MUT-LINC00963的荧光素酶活性分别为1.02±0.05、1.00±0.06，miR-525-5p组WT-LINC00963和MUT-LINC00963的荧光素酶活性分别为0.62±0.04、1.03±0.07，WT-LINC00963的荧光素酶活性在miR-NC组和miR-525-5p组之间差异有统计学意义(P<0.05)，MUT-LINC00963的荧光素酶活性在miR-NC组和miR-525-5p组之间差异无统计学意义(P>0.05, 图 4B)。miR-525-5p表达水平在pcDNA-LINC00963组(0.33±0.03)显著低于pcDNA组(1.00±0.05)(P<0.05)， si-LINC00963组(2.71±0.21)却显著高于si-NC组(0.98±0.07)(P<0.05)(图 4C)。

图 4 LINC00963靶向调控miR-525-5p的表达

2.5 miR-525-5p过表达对LPS诱导牙周膜细胞损伤影响

miR-525-5p过表达后，LPS+miR-525-5p组牙周膜细胞中miR-525-5p表达水平是LPS+miR-NC组的约3.01 倍，TNF-α、IL-1β水平、凋亡率和Bax蛋白水平分别比LPS+miR-NC组减少了约0.25、0.30、0.53、 0.59 倍，Bcl-2蛋白水平比LPS+miR-NC组增加了约1.18 倍(P<0.05)(图 5)。

图 5 miR-525-5p过表达对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的影响

2.6 下调miR-525-5p表达逆转了干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的作用

同时下调miR-525-5p和干扰LINC00963表达后，LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p组牙周膜细胞中miR-525-5p表达水平低于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC组，TNF-α、IL-1β水平、凋亡率和Bax蛋白水平高于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC组，Bcl-2蛋白水平低于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC组(P<0.05)(图 6)。

图 6 下调miR-525-5p表达逆转了干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的作用

3 讨 论

LPS也称为内毒素，是炎症反应的有效激活剂，导致炎症因子如IL-1β， IL-6， IL-8和TNF-α等炎症因子的过度产生[10-11]。本研究同样利用LPS诱导牙周膜细胞损伤，检测到了LINC00963的上调。在乳腺癌[12]、骨肉瘤[13]、胃癌[14]等癌症中， LINC00963通过调节肿瘤细胞的生长、凋亡、转移、分化等过程促进癌症的恶性进展。此外，根据Xie等[5]的研究结果，在缺氧诱导的HK-2细胞模型和缺血再灌注诱导的急性肾损伤大鼠模型中，LINC00963的表达均增加。本研究发现干扰LINC00963表达可通过抑制促凋亡蛋白Bax表达、促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达来减少LPS诱导的牙周膜细胞凋亡。促炎因子TNF-α和IL-1β是牙周炎中炎性损伤的重要调节剂[15]。本研究表明，干扰LINC00963表达抑制了炎症因子TNF-α、IL-1β的表达。通过检测这些指标，本研究发现，干扰LINC00963表达可降低炎症因子TNF-α、IL-1β的表达和细胞凋亡，从而在牙周炎中起保护作用，这与Chen等[6]报道的si-LINC00963减少慢性肾功能衰竭大鼠模型中TNF-α、IL-6及细胞凋亡率、Bax和增加Bcl-2的结果相类似。

大多数lncRNA主要靶向miRNA以发挥其功能[16]。本研究中，miR-525-5p是牙周膜细胞中LINC00963的直接靶标。miR-525-5p作为一种肿瘤抑制因子，被确定在胶质瘤[17]、宫颈癌[18]中表达下调。最近的研究表明， miR-525-5p减轻了Ang-II处理的心肌细胞的肥大反应[19]。但miR-525-5p在牙周炎中的功能仍然未知。本实验中，牙周膜细胞中的miR-525-5p被LPS下调，miR-525-5p过表达通过抑制细胞凋亡和炎症因子TNF-α、 IL-1β表达，在LPS诱导的牙周膜细胞中显示出有益作用。此外，下调miR-525-5p后，干扰LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的保护作用被逆转，这表明下调miR-525-5p可以反向增加被si-LINC00963减少的LPS损伤牙周膜细胞的凋亡和炎症因子表达，也表明LINC00963通过靶向LINC00963实现对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的调节作用。

总之，本研究首次发现，在LPS诱导的牙周膜细胞中，LINC00963表达增加，干扰LINC00963表达抑制LPS诱导的牙周膜细胞凋亡和炎症因子表达，可能与靶向miR-525-5p有关。本研究结果表明，LINC00963和miR-525-5p可能成为治疗牙周炎的新靶标。