荧光标识生物分子检测系统研究及性能分析*

倪　原，刘凯涛，倪中辰，赵　阳，王红娟，魏　静（．西安工业大学电子信息工程学院，西安700；．西安启源机电装备股份有限公司，西安7008）



荧光标识生物分子检测系统研究及性能分析*

倪原1，刘凯涛1，倪中辰2，赵阳1，王红娟1，魏静1
（1．西安工业大学电子信息工程学院，西安710021；2．西安启源机电装备股份有限公司，西安710018）

摘 要：为了确定待测样品中是否存在某种特定的基因、蛋白质，设计了一种能够对荧光探针标识的生物分子进行检测的荧光偏振系统．本文分析了分光光度法、共振光散射分析法所存在的问题和荧光偏振检测的优势和特点，研究了荧光偏振检测系统的原理，设计了检测光路和测控系统，并进行了大量的生物检测实验，实验结果表明该检测系统能够确定待测样品中是否存在需要检测的物质，其测试的重复性误差小于3%，正确率可达到100%，孔位测试不均匀性小于2%．

关键词：荧光；偏振光；检测系统；生物分子

基金资助：陕西省教育厅产业化项目（07JC06）

在现代的临床疾病诊断、环境保护等方面，经常会遇到针对特定的基因、蛋白质存在的检测问题．在该系统研制之初，国外大半数医疗单位已经装备了该类系统，国内仅有少量此类系统，大多分布在有影响的医疗单位，而且主要是以进口为主，价格昂贵，除此之外，现有该类系统大多仅能进行基因检测，检测样品的数量和范围受到限制，且易产生假阳性，因此迫切需要研制出成本低、检测数量多、结果准确的荧光偏振检测系统．该类仪器在国内具有良好的发展前景，产生的效益不可低估［1］．文献［2-3］介绍了分光光度法，他是通过二苯胺与样品结合后产生有色产物，然后对有色产物进行检测得到结果的方法，该方法准确度高，但耗时长、灵敏度低且受干扰的可能性大．文献［4］介绍了共振光散射分析法，它是一项在普通荧光分光光度计上进行测量的光散射分析方法，该方法有较高的灵敏度和选择性，但检测自动化程度较低．文中针对分光光度法所存在的不能进行高通量检测、灵敏度低和共振光散射分析法所存在自动化程度低、检测成本高等缺点，采用荧光偏振原理，设计了一种荧光偏振检测系统．

1　荧光偏振原理

荧光偏振值［5］是利用垂直方向的偏振光激发荧光分子，然后测量发射偏振光在水平方向和垂直方向的荧光强度值，则有

式中：P为荧光偏振值；N和M分别为偏振光在水平和垂直方向荧光强度值．

荧光偏振值与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比，分子量小的，运动速度快，P值小；分子量大的，运动速度慢，P值大，因此，当荧光标示物通过生化反应与要检测的分子结合后，分子量极大，P值就大，当样品中无该检测物质时，P值就小．因此由式（1）所测得的荧光偏振值（P）的大小，即可确定待测样品的性质．

荧光偏振检测过程：光源发出的光经过激发滤光器和起偏振器后，通过激发滤光器和起偏振器的作用，照射到样品表面的是固定波长、固定方向的光，而样品发出的是另一波长的光，该光经过检偏器和发射滤光器后，进入PMT（光电倍增管）的检测小窗中［6］．由于样品性质的不同，表现出光的偏振大小也不同，因此由式（1）可知将激发光的方向定为某一固定的方向，通过测出发射光各个方向的强弱便可得知样品的性质．

2　荧光偏振系统硬件设计

2．1 系统整体架构

荧光偏振检测系统实现的功能主要包括：①样本自动选择及位置控制；②光源光强自动调整；③激发滤光片自动选择；④发射滤光片自动选择；⑤荧光信号采集及信号处理；⑥与上位机通信．根据功能需求所设计系统由主控制器、光源、激发光路、发射光路、步进电机、电机驱动器、光电倍增管、光电二极管等装置组成．选择ARM LPC1768处理器作为主控制器，根据光强要求采用80 W卤素灯作为光源系统中使用光电倍增管进行荧光信号的采集，灵敏度高．由于不同样本中所加荧光物质不同，激发和发射的光波长也不同．因此，激发光路和发射光路设计有多种滤光片组合，根据需要自动选择．各光路中的镜片位置及样品盘位置控制由步进电机及细分驱动电路和机械定位装置实现，不仅位置控制精确，而且避免了人工操作所带来的污染．在检测过程中，需要保证激发光的亮度不变，因此使用光电二极管采集光源的亮度变化，通过处理器控制光源驱动电路使激发光亮度恒定．系统整体架构如图1所示．

图1　系统整体架构Fig．1 System framework

2．2 主控制电路设计

在设计时，为了简化外围电路设计，提高系统的集成度、可靠性同时能够得到较快的运算处理速度，因此选用了基于Cortex-M3内核的LPC1768为微控制器．ARM Cortex-M3 CPU具有三级流水线和哈佛架构，带独立的本地指令和数据总线以及用于外设的性能稍低的第三条总线，ARM Cortex-M3 CPU还包含一个支持随机跳转的内部预取指单元．内置了512 KB的Elash存储器、64 KB的数据存储器；4个UART；8通道的12位ADC、10位DAC；4个通用定时器；6输出的通用PWM；带独立的电池供电的超低功耗RTC以及多达70个的I／O引脚［7］．LPC1768的最小系统主要由晶振、电源、复位以及JTAG电路组成，处理器的P2．0-P2．9端口，通过EIO2DIR寄存器设置为输出端口，与步进电机驱动电路相连接，用以控制步进电机，系统因为使用较多步进电机，可以使用其他端口进行类似设置；通过EIO0DIR、EIO0SET、EIO0CLR寄存器对P0．4-P0．10进行输入输出以及初始值的设置，将其与A／D转换器连接，用以将采集的荧光信号和光源亮度信号变为数字量输入到处理器中；通过设置PINSEL1寄存器将引脚P0．26设置为AOUT功能，将模拟量输入到光源驱动电路用以保持光源亮度恒定；通过设置PINSEL0寄存器，配置P0．2、P0．3引脚为TXD0，RXD0功能，与MAX232连接，从而与上位机进行通信．

2．3 步进电机驱动电路设计

针对不同的样本，本系统中激发光路和发射光路中镜片的选取及镜片位置的改变，都需通过步进电机来实现，而为了提高步进的精度和改善步进电机的低频振动，因此设计了步进电机驱动电路．

系统中使用两片NJM3717驱动步进电机，使用LPC1768的P2端口、SN74ALVC16245将3．3 V电平转换为5 V电平，之后再使用74 HC273与外接电阻组成的细分电路与NJM3717连接，从而驱动步进电机运行。第一片的NJM3717的MB、MA引脚和第二片NJM3717的MB、MA引脚分别接步进电机的两相输入输出口，为其提供工作电流。本设计中选用57BYGH型步进电机，其整步运行时步距脚为1．8度，单步运行时为0．9度，使用该细分电路32细分时经过计算，步进电机每一微步步进距离的精度可以达到0．007 mm．该步进电机驱动电路的优势在于通过简单的器件连接实现了步进电机控制器的作用，节省了成本，同时有效地改善了步进电机的动态性能．

2．4 信号检测电路设计

在本系统中信号检测电路包括荧光信号检测电路和激发光亮度采集电路．在荧光信号的检测过程中，激发光强度必须保持恒定．

2．4．1 荧光信号检测电路设计

在系统中，器件的选取以及荧光信号检测电路设计的好坏，直接影响了系统最后的检测结果，因此选用了滨松光子的H7712-12型光电倍增管，该光电倍增管有着180～900 nm的宽光谱效应，电流-电压转换系数为0．1 V／μA，频率带宽为200 k Hz，并有着极好的输出稳定性．光电倍增管［8］将微弱的荧光信号转换为微弱的、频率较高的电流信号，然后将电流信号滤波放大后变为电压信号经A／D转换器输入到CPU去处理．其电路如图2所示．光电倍增管输出的电流信号接J1，经滤波、I／V变换、放大后将电流信号变为电压信号O-A，将O-A输入到A／D转换器中变为数字量用以微控制器处理．其中放大电路使用的是TLC274A，通过两级放大后转换为0～5 V的A／D转换器可以使用的电压信号．

图2　荧光信号检测电路Fig．2 The detection circuit of fluorescence signals

2．4．2 光源亮度采集电路

在检测过程中，为了排除光源亮度的变化对检测结果的影响，在整个检测过程中要保持光源亮度不变，因此设计了光源亮度采集电路，通过亮度采集电路，将当前光源强度值输入到A／D转换器中，采用PID控制和光源驱动电路配合达到控制光源强度的目的，实现光源的亮度恒定．光源亮度的采集使用的是光电二极管，将光亮度的变化转换为电流信号的变化．其电路如图3所示．J1接光电二极管的输出，滤波放大后变为电压信号O-B．其中放大器使用的是TLC274A．

2．5 通信电路设计

在该偏振检测系统的检测过程中，需要将下位机的数据实时的传输到上位机上，因此需要在上位机和下位机之间进行通信，从而设计了串口通信电路。电路使用MAX232A将TTL电平转换为RS232电平，MAX232A的11引脚和12引脚分别连接LPC1768的RXD0引脚和TXD0引脚，通过9脚端子连接到上位机的串行接口．

图3　激发光亮度采集电路Fig．3 The acquisition circuit of excitation light intensity

3　系统软件设计

在软件设计方面，LPC1768用的是C／C＋＋编译器，能方便的在MDK下进行程序的编写和调试，减小了开发难度和开发周期，节约了开发成本．

针对系统的整体功能，软件方面要能够实现系统的自检、荧光偏振的检测、数据的上传等功能．

系统上电后首先对系统的存储器、寄存器等进行初始化，然后按照上位机的相关指令进行系统自检，以确保系统能够进行正常的工作．若系统自检不正常，显示错误码后结束；若系统自检正常，按照相关指令调整试剂盘到检测位置、打开光源、调整激发和发射滤光片、选择垂直和水平偏振片、试剂盘退回等步骤后，完成荧光检测，荧光检测程序主要是得到荧光的垂直偏振强度M和水平偏振强度N，通过式（1）计算得到P值并返回到上位机［9］．根据P值的大小即可明确试剂的性质．

4　系统性能测试及分析

4．1 统重复性误差

实验方案：选择2种荧光试剂，针对12种样品进行测试，重复性参数测试结果见表1．

测试方法是分别对A1～A7、A8～A12孔进行重复测试，每隔1分钟测试一次．根据

可计算出每组数据的的标准差和重复性误差值，由表一可知系统重复性误差（CV）小于3%，满足性能要求．

表1　重复性测试数据Tab．1 Test data of repeatability

4．2 系统灵敏度

系统灵敏度测试：将所研发的荧光偏振检测仪器检测结果与国外同类仪器的检测结果进行比较，检测的阴阳性结果完全一致．结果见表2．

表2中偏振值P（P1、P2）的计算公式为P＝1 000*（M－G*N）／（M＋G*N），其中G为校正因子，取值为1．121．M为垂直偏振光强度，N为水平偏振光强度．其中M1、N1为国外对照仪器检测的垂直和水平偏振光强度，M2、N2为研发的仪器检测的垂直和水平偏振光强度，两者阴阳性检测结果相符合，对大于5个copies的样品，阴阳性检测测出正确率率可达到100%，满足性能要求．

表2　灵敏度测试数据Tab．2 Test data of sensitivity

4．3 系统孔位测试不均匀性

测试方法：在E15～E22孔位放置同样试剂，进行重复检测．检测结果见表3．

系统经过测试其重复性误差、灵敏度和孔位不均匀性测试均满足设计要求，并与进口设备进行双荧光测试数据比较，检测结果一致．

表3　孔位不均匀性测试数据Tab．3 Test data of holes unevenness

5　结论

针对基因、蛋白质以及荧光标示物标识的有机物分子的存在检测问题，研究了荧光的偏振原理，并设计了基于ARM的荧光偏振检测系统．通过选取2种荧光试剂，12种样品进行了临床试验与结果分析，结果表明该系统运行稳定，能够同时进行384个样品的检测，实现了多数量、多种样品的检测，而且检测精度高，检测结果准确，其重复性检测误差小于等于3%，正确性检测测出正确率为100%，均满足系统设计性能要求．

参考文献：

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（责任编辑、校对 张立新）

Detection System of Fluorescently Labeled Biological Molecules and Its Performance Analysis

NI Yuan1，LIU Kaitao1，NI Zhongchen2，ZHAO Yang1，WANG Hongjuan1，WEI Jing1
（1．School of Electronic Information Engineering，Xi’an Technological University，Xi’an 710021，China；2．Xi’an Qiyuan Mechanical and Electrical Equipment Co．，Ltd．，Xi’an 710018，China）

Abstract：In order to determine whether there is specific gene or protein in the sample，a fluorescent polarization system for detecting biomolecules was designed．This paper analyzes the disadvantages of the spectrophotometry and resonance light scattering analytical methods，deseribes the advantages and characteristics of the fluorescence polarization detection，studies the principle of fluorescence polarization detection system，and designs the optical path and the control system．A large number of biological testings were conducted with the new system．Experimental results show that the detection system is able to determine whether there is substance to be detected in the sample．The repeatability error is less than 3%，the accuracy rate is up to 100%and the unevenness of the holes test is less than 2%．

Key words：fluorescence；polarized light；detection system；biological molecules

作者简介：倪 原（1955－），男，西安工业大学教授，主要研究方向为医学仪器．E-mail：ny930＠xatud．edu．cn．

*收稿日期：2015-04-23

DOI：10．16185／j．jxatu．edu．cn．2016．01．003

文献标志码：中图号： TP216＋．3 A

文章编号：1673-9965（2016）01-0008-06