基于EST序列的玫瑰EST—SNP位点发掘与分析

梁芳　张 继　吕平　龙凌云　黄惠芳　檀小辉　韦丽君

摘要：【目的】发掘出一批玫瑰SNP候选位点，为进一步开发玫瑰EST-SNP标记及研究玫瑰遗传背景、相关性状的分子标记等打下基础。【方法】从美国国立生物技术信息中心（NCBI）的dbEST数据库下载27125条玫瑰EST序列，经生物信息学方法分析，发掘玫瑰EST-SNP位点，并对其所在核苷酸序列进行功能注释分析。【结果】对27125条EST进行拼接，共得到3544条重叠群（Contigs），其中有243个Contigs含有SNP候选位点。从中筛选出224个候选EST-SNP位点，其碱基突变类型中转换和颠换的数量分别占SNP候选位点总数的59.8%和27.2%。通过序列比对分析，发现有22个SNP位点来源于蔷薇科植物（与玫瑰同科），其中來源于野草莓的基因最多（8个），另有15个SNP位点所在的EST序列与某些软体动物门物种的基因具有较高同源性。【结论】NCBI中的玫瑰EST数据库数据庞大，足够发掘出大量的SNP标记，使得以EST-SNP对蔷薇科玫瑰等植物进行品种鉴定、分类、遗传多样性分析具有可行性。

关键词： 玫瑰；EST序列；SNP位点；生物信息学；NCBI

中图分类号： S685.12 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-325-07

0 引言

【研究意义】玫瑰（Rosa rugosa）是蔷薇科重要的观赏植物，因其具有芳香且抗黑斑病、耐盐碱等特性而成为蔷薇科观赏植物育种的重要资源（Von Malek et al.，2000；冯立国等，2008；于晓艳等，2009）。我国的玫瑰种质资源丰富，但品种间的亲缘关系混乱，给其品种鉴定、分类及品种权保护带来很大困难，进而制约了玫瑰育种进程及其产业的发展，因此，对玫瑰进行品种鉴定、分类、遗传多样性分析是玫瑰研究的当务之急。发掘玫瑰单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）就是利用SNP对玫瑰进行品种鉴定、分类及遗传多样性研究，可为玫瑰育种提供新途径。【前人研究进展】自Picoult-Newberg等（1999）首次以表达序列标签（Expressed sequence tags，EST）数据库为基础发掘SNP位点以来，许多学者依照此法对不同物种进行了大量研究，目前已在人类（Garg et al.，1999）、小鼠和大鼠（Guryev et al.，2004）、牛（Snelling et al.，2005）、猪（Kerstens et al.，2009）及水产（曾地刚等，2014）等领域得到广泛应用。近年来，EST-SNP标记的开发在植物上也得到推广应用，如拟南芥（Torjék et al.，2003）、玉米（Batley et al.，2003）、水稻（Feltus et al.，2004）、松树（Dantec et al.，2004）、番茄（Yamamoto et al.，2005）和大麦（Kota et al.，2008）等。在蔷薇科植物中，多选择对梅、桃、杏、枇杷等经济果树进行分子系统发育进化及遗传多样性等研究，如王俊（2013）利用美国国立生物技术信息中心（NCBI）中已公布枇杷基因的部分序列为模板设计引物，筛选出7对引物进行基因克隆及同源性比对分析，结果表明，在不同枇杷品种间存在丰富的SNP位点。张得芳等（2014）也利用EST资源库下载相关数据进行分析，找到了EST- SNP位点在蔷薇科蔷薇属、苹果属、梨属、李属、草莓属和悬钩子属等6个属间的分布规律和特点。【本研究切入点】虽然关于EST-SNP位点开发的研究已有较多报道，但尚未发现在玫瑰中开发SNP标记。【拟解决的关键问题】从NCBI的玫瑰EST数据库下载大量EST数据，通过生物信息学方法发掘出一批玫瑰SNP候选位点，以期为进一步开发玫瑰EST-SNP标记及研究玫瑰遗传背景、相关性状的分子标记等打下基础。

1 材料与方法

1. 1 玫瑰EST获得及多序列聚类簇分析

从NCBI的dbEST数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=rose）下载27125条玫瑰EST序列，所有EST序列均以FASTA格式保存。利用DNASTAR 7.1.0（44.1）软件包中的SeqMan程序对下载的玫瑰EST序列进行聚类，属于同一个基因的EST聚类为1个Cluster，并对其进行序列拼接得到重叠群（Contigs）。

1. 2 玫瑰EST-SNP位点筛选及分析

玫瑰EST-SNP位点筛选用DNASTAR软件包中的SeqMan程序检测并去除所有玫瑰EST序列中存在的载体序列，然后组装拼接成Contigs。筛选EST-SNP位点原则：①候选SNP位点中的次要等位基因频率至少为30%（李猛等，2012）；②候选SNP位点两侧至少有5 bp完全保守的序列。为筛选出可靠性更高的候选SNP位点，本研究对筛选方法进行如下优化：①从拼接结果中提取含有20条以上（包括20条）EST序列的Contigs筛选SNP位点；②候选位点人工筛选时，从步骤①中筛选出的候选SNP位点两侧至少有8个碱基（bp）完全保守且次要等位基因所占比例不低于40%。

1. 3 候选SNP所在核苷酸序列同源性比对

提取候选SNP位点两端各约50 bp的EST序列，用NCBI上的BLASTn（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&L-

INK_LOC=blasthome）数据库进行序列比对，提取与比对序列相似性最高的序列注释信息，对SNP靶向基因产物及物种来源进行分析。

2 结果与分析

2. 1 玫瑰EST序列聚类及EST-SNP位点分析结果

利用DNASTAR 7.1.0（44.1）软件包中的SeqMan程序去除载体序列后，对27125条EST进行拼接，共得到3544条Contigs。

2. 2 SNP位点人工筛选及分析结果

2. 2. 1 SNP位点人工筛选方法 对软件筛选出的候选SNP位点进行人工筛选，进一步提高候选SNP位点的可靠度。本研究在筛选候选SNP位点时，把包含4条EST序列的Contigs提高到至少包含20条EST序列的Contigs，同时在1个候选SNP位点两侧经常出现间断或连续的非SNP位点不保守区域。这些区域可能是在比对分析时序列错误所引起，从而降低候选SNP位点的可靠度，为此本研究对人工筛选原则进行以下改良：①候选SNP位点次要等位基因频率不低于40%；②候选SNP位点两侧至少有8个核苷酸序列完全保守（图1为合格SNP，图2和图3均为不合格SNP）。经过筛选，发现含候选SNP位点的Contigs有243个，243个Contigs的碱基总数为262785 bp；经过人工筛选，发现有224个SNP位点，SNP出现频率为0.085%，即平均1173 bp就含有1个SNP位点（表1）。对Contigs中含有SNP位点的Contig进行统计分析，结果（图4）显示构成Contigs的EST序列数量与其包含的SNP位点数量并无明显规律。

2. 2. 2 SNP碱基变化及插入缺失分析结果 对包含EST数量大于20条的Contigs产生的224个碱基突变类型进行统计分析，结果发现有134个转换类型和61个颠换类型（图5），分别占候选SNP位点总数的59.8%和27.2%，转换与颠换比为2.2∶1.0。除转换和颠换类型之外，还有29个碱基发生插入和缺失类型，约10个碱基突变中就有1.29个碱基发生插入或缺失突变。

2. 3 候选SNP位点所在核苷酸序列同源性比对结果

提取195个转换和颠换SNP位点位置两侧约100 bp的核苷酸序列在NCBI核苷酸数据库中进行比对，发现有41个SNP位点无比对结果，可能是玫瑰特有且尚未被发现的基因，但需进一步验证；其他SNP位点的比对结果见表2。由表2可知，含SNP位点的基因分属于22类，分别为：1个3，5-二甲氧基基因（AB972813.1），含有1个SNP位点；1个5羟基甲苯3，5-二甲氧基基因（AF502434.1），含有1个SNP位点；1个60S酸性核糖体蛋白P2（EU244401.1），含有1个SNP位点；3个KRMP基因家族成员（KC494061.1、EF183518.1和EF183519.1），含有3个SNP位点；1个捕光叶绿素a/b结合蛋白（XM_004303830.2），含有1个SNP位点；2个ribosomal基因（KT179782.1），含有2个SNP位点；2个shematrin基因家族基因（KC505165.1和KC505166.1），含有2个SNP位点；1個二磷酸羧化酶基因（M25613.1），含有1个SNP位点；1个翻译延伸因子1A基因（AY171463.1），含有1个SNP位点；2个泛素蛋白基因（XM_010086632.1和XM_013082359.1），含有2个SNP位点；1个非特异性脂转移蛋白基因（XM_011468119.1），含有1个SNP位点；1个富含甘氨酸蛋白基因（XM_011468831.1），含有1个SNP位点；1个甲氧基5羟基甲苯基因（AF502433.1），含有1个SNP位点；2个金属硫蛋白基因（AJ001444.1和KC222014.1），包含1个SNP位点；2个壳基蛋白基因（HE610403.1和HE610383.1），含有2个SNP位点；1个衰老相关蛋白基因（XM_013587541.1），含有1个SNP位点；5个苔黑酚转甲基酶蛋白基因（AJ439741.1、HQ423170.1、AM182831.1、AM182833.1和AB972813.1），含有5个SNP位点；2个铁结合蛋白基因（KM369969.1和XM_004302530.2），含有2个SNP位点；3个细胞色素氧化酶亚基基因（DQ337258.1、KF284069.1和GQ452847.1），含有3个SNP位点；1个淀粉酶基因（XM_004296501.2），含有1个SNP位点；1个珍珠层蛋白基因（HQ259055.1），含有1个SNP位点；另外，还有6个未知功能的基因（FN566841.1、XM_004291435.2、EU244360.1、HG670306.1、EF119787.1和GU263799.1）。

从含有SNP位点相关同源基因的物种分布来看，有22个SNP位点来源于蔷薇科植物（与玫瑰同科），其中来源于野草莓的基因最多（8个），说明同科植物基因间存在较高同源性。本研究还发现有15个SNP位点所在的基因与软体动物门物种的基因具有较高同源性，其中大珠母贝和黑蝶真珠蛤所占比重最高，各有5个，说明玫瑰基因与某些水生软体动物的基因也具有较高同源性。

3 讨论

目前，SNP已在遗传连锁图谱构建（Hyte et al.，2010）、重要性状相关基因定位（Singh et al.，2010）、遗传多样性分析（Van Inghelandt et al.，2010；吴永升等，2014）及动植物品种鉴定（Jiang et al.，2010）等相关领域的研究中得到广泛应用，基于EST序列的SNP标记也被应用到牛、猪、玉米、小麦、松树、枇杷等多种动植物中，但SNP标记也存在缺陷，如测序阶段成本较高而限制其在相关领域的大规模开发。利用现有数据，并结合生物信息学知识及相关分析软件进行SNP标记开发，再制定针对候选SNP位点的验证方法，因其具有开发成本低、快捷高效等优点，已成为广大科研工作者普遍青睐的SNP标记开发方法（Kim and Misra，2007）。EST来源于功能基因表达的cDNA片段，是在转录区域进行多态性辨别的重要数据源，且因相关公共数据库中增速最快的核苷酸序列是EST序列，使得以EST序列为基础进行相关分子标记开发变得越来越方便。

本研究中从NCBI中dbEST公共数据库下载27125条EST序列，共有17372条EST序列参与拼接，拼接成3544个Contigs，所含EST序列≥20条的Contigs数共265个，从中筛选出224个候选SNP位点，SNP频率为 1/1173 bp，较其他物种的SNP频率低（Lijavetzky et al.，2007），主要与研究材料间的遗传背景差异有关，即SNP频率越高表明其遗传背景差异越大（Van Tassell et al.，2008）。本研究还发现，SNP位点碱基变异类型以G/A最高占59.8%，与人类、大豆、玉米、大麦、小麦、辣椒等物种的SNP碱基变异类型（Huang and Madan，1999；Chao et al.，2008；Sato et al.，2011；刘峰等，2014）不符。其中，转换类型和颠换类型的数量分别占候选SNP位点总数的59.8%和27.2%，转换与颠换比为2.2∶1.0，即转换类型的数量明显高于颠换类型数量，与Garg等（1999）、Deutsch等（2001）的研究结果一致。此外，构成Contigs的EST序列数量与其包含的SNP位点数量并无明显规律，与Duran等（2009）、周锦等（2011）的研究结果存在差异，可能与不同物种间SNP位点的分布差异有关系。本研究筛选获得的SNP位点中有42个位点被注释到22个基因上，未被注释的序列多为未知功能基因，尚需进一步探究。除有22个SNP位点来源于蔷薇科植物外，还有15个SNP位点来源于软体动物门物种，是前人研究中未发现的现象，值得深入研究。

随着测序技术的快速发展，测序的准确率及效率也将不断得到改进，通过生物信息学知识及相关分析软件发掘候选SNP位点，然后针对性地进行测序验证将成为一种高效的SNP标记开发方式。尤其是EST-SNP的高效开发，将进一步推动植物遗传背景、遗传图谱构建、相关性状分子标记等相关研究领域的发展。

4 结论

NCBI中的玫瑰EST数据库数据庞大，足够发掘出大量的SNP标记，使得以EST-SNP对蔷薇科玫瑰等植物进行品种鉴定、分类、遗传多样性分析具有可行性。

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（責任编辑 兰宗宝）