ICP-MS法测定蛹虫草菌丝体干粉中12种金属元素

王　晶， 黄伟雄， 梁晓艳， 胡军高， 梁旭霞*

（1.广东省疾病预防控制中心，广东广州511430；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011）



ICP-MS法测定蛹虫草菌丝体干粉中12种金属元素

王晶1， 黄伟雄1， 梁晓艳2， 胡军高1， 梁旭霞1*

（1.广东省疾病预防控制中心，广东广州511430；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011）

摘要：目的 建立电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定蛹虫草CordycePsmilitaris菌丝体干粉中铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、砷（As）、银（Ag）、镉（Cd）、锑（Sb）、钡（Ba）、铅（Pb）的含有量。方法 湿法消解处理样品后，ICP-MS法测定其中12种金属元素的含有量。结果 12种金属元素的检出限较低，相关系数均>0.999 2。经冻干榉木叶粉和茶叶验证，该方法准确度和精密度良好。结论 蛹虫草菌丝体干粉中的金属元素均符合相关国家标准。

关键词：蛹虫草菌丝体；干粉；金属元素；ICP-MS

蛹虫草CordycePsmilitaris是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目等昆虫蛹体上，形成一种虫或蛹与菌的结合体，在生物分类学上归属于真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属［1］。冬虫夏草与蛹虫草都是我国传统名贵中药材，前者属于高海拔地区特有的珍贵物种，资源紧缺、价格高昂，而后者与冬虫夏草同属异种，分布相对广泛。两者的化学成分、药用功能都非常相似，但蛹虫草主要药用活性成分（如虫草素、腺苷等）的含有量高于冬虫夏草［2-3］，而且易于人工栽培，故被选为冬虫夏草的最佳替代品。

蛹虫草已被国家批准为新资源食品［4］，因此对其质量要求、安全性以及有害成分的控制提出了新的要求。随着我国工业发展，环境污染状况日益严峻，野生蛹虫草的生长受环境（土壤、气候、供肥条件等）影响较大，质量不稳定。此外，其具有较强的环境重金属富集能力［5-8］，并影响其药用活性成分的含有量［9-10］。现有研究大多关注于蛹虫草的药用活性成分及其影响因素，但鲜有与药食两用安全性有关的重金属种类及含有量分布的报道。因此，本实验利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）仪测定其中铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、砷（As）、银（Ag）、镉（Cd）、锑（Sb）、钡（Ba）、铅（Pb）的含有量，为深入了解重金属元素在蛹虫草菌体内的分布和作用规律提供技术支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 7700X电感耦合等离子体质谱仪，包括MassHunter工作站软件（美国Agilent公司）；Direct-Q3超纯水处理系统（德国Merck Millipore公司）；高纯氩气（99.999％，广州气体厂有限公司）；DS-360智能石墨消解仪（常温～210℃，广州格丹纳仪器有限公司）；精密微量移液器（10、20、50～100、200 μL，德国Eppendorf公司）；XPE204电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；圆底硬质玻璃消化管（50 mL）；塑料试管（15 mL，美国BD公司）。

1.2 试剂 蛹虫草菌丝体干粉共3批，批号分别为150101、150102、150103（广东某保健品公司）。硝酸为优级纯（德国Merck公司）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

冻干榉木叶粉（编号BCR-100，30 g/瓶，欧洲参考物质研究所与测量委员会联合研究中心）；茶叶（编号INCT-TL-1，50 g/瓶，波兰核化学与技术研究院）。

安捷伦多元素混合标准溶液［基体为10％ HNO3，其中铁（Fe）元素质量浓度为1 000 μg/mL，铬（Cr）、锰（Mn）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、砷（As）、银（Ag）、镉（Cd）、锑（Sb）、钡（Ba）、铅（Pb）元素质量浓度均为10 μg/mL，编号5183-4688］；安捷伦多元素内标混合液［基体为5％HNO3，含有锂（Li）、钪（Sc）、锗（Ge）、钇（Y）、铟（In）、铽（Tb）、铋（Bi）7种元素，其质量浓度均为10 μg/mL，编号5183-4680］；安捷伦多元素ICP-MS仪器调谐溶液［基体为2％HNO3，含有锂（Li）、钇（Y）、铈（Ce）、铊（Tl）、钴（Co）5种元素，其质量浓度均为10 ng/mL，编号5184-3566］。

2 方法

2.1 样品消化 分别精密称取各批蛹虫草菌丝体干粉样品4份（含平行样品），称样量分别为0.417 8、0.428 5、0.427 7和0.425 8 g，置于50 mL圆底硬质玻璃消化管中，并加入优级纯浓硝酸10 mL，将消化管置于智能石墨消解仪中，低温预消解至样品全部溶解，升温至120℃，维持4 h，再升温至160℃消解，若溶液出现炭化，可适当补加硝酸继续消化，直至样品清澈透明，呈淡黄色，最后180℃赶酸至约1 mL［11-12］。同时，制备样品空白，以冻干榉木叶粉与茶叶两种有证参考物质为质量控制样本，同法处理，并制备质控样本。所有样品消化液均转移至15 mL BD塑料试管中，少量纯水多次洗涤消化管，合并洗涤液与消化液，最后定容至10 mL，摇匀，待测。

2.2 溶液配制

2.2.1 多元素混合标准曲线溶液配制 5％HNO3将安捷伦多元素混合标准溶液逐级稀释成系列标准曲线溶液，质量浓度分别为Fe 0.00、0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 μg/mL，Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Pb 0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL。

2.2.2 混合内标使用液配制 5％HNO3将10 μg/mL Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi安捷伦内标混合液稀释为1.0 μg/mL内标使用液。

2.2.3 ICP-MS仪器调谐使用液配制 5％HNO3将10 ng/mL Li、Y、Ce、Ti、Co安捷伦多元素ICPMS仪器调谐溶液稀释为1 ng/mL质谱调谐使用液。

2.3 ICP-MS仪器实验条件 测定各元素时，均采用氦气碰撞消除多原子离子干扰模式，各主要仪器操作条件和参数见表1。将标准系列、样品空白、样品溶液、质控样品依次上机进行检测，采集数据，进行计算。

表1　操作条件及参数Tab.1 Operation conditions and parameters

2.4 方法学技术参数

2.4.1 检出限与定量限测定 同时制备21份湿法消化的样品空白溶液，定容后上机测定对应金属元素含有量，依据食品卫生检验方法（理化部分）注解［13］及《中国药典》2010版［14］有关规定，计算方法检出限与定量限。

2.4.2 标准工作曲线绘制 将系列质量浓度标准溶液上机测定，以各元素与虚拟内标每秒计数（CPS）的比值为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线。

2.4.3 回收率与精密度测定 精密称取平行样品12份，先测定3份来计算各元素的本底含有量，剩余9份按低、中、高3个不同梯度分别加入多元素标准溶液，每3份对应1个梯度，同时消化并定容，上机测定各元素质量浓度，并计算回收率与精密度［13-15］。

2.4.4 质量控制 同时消化蛹虫草菌丝体干粉样品、3份茶叶及3份冻干榉木叶粉有证参考物质，同法测定，计算各元素平均值与相对标准偏差，并与参考证书中的标示值进行比较，结合相对标准偏差来分析方法准确性与精确度。

2.4.5 方法稳定性实验 将消化定容好的样品溶液于24 h内连续测定3次。放置1个月后，分别在第1天、第2周、第3周用同样的仪器分析条件进行测定，分别计算平均值与相对标准偏差，考察方法稳定性。

2.5 样品测定 根据建立的分析方法和标准工作曲线，测定上述空白、样品和质控溶液中各金属元素的含有量，含平行样的批次样本测定结果取其平均值。

3 结果

3.1 方法学参数

3.1.1 检出限与线性范围 各金属元素的方法检出限、定量限以及相关系数见表2，发现各元素的检出限都较低，方法灵敏度高，相关系数均大于0.999 2，符合分析要求［15］。

表2　检出限与线性范围Tab.2 Detection lim its and linear ranges

3.1.2 方法回收率试验 低、中、高3个梯度溶液的加样回收率分别为90.4％～103％、89.9％～103％、91.6％～104％，达到分析要求［15］，具体见表3。

3.1.3 精密度试验 在低、中、高3个梯度溶液中，各元素RSD最大值分别为2.1％、2.4％、1.6％，表明仪器精密度良好。

3.1.4 稳定性试验 日内误差与日间误差的RSD均在0.5％～3.1％之间，表明该方法稳定性良好。

3.1.5 有证参考物质（质控样品）的验证 冻干榉木叶粉和茶叶检测结果显示，该方法回收率较高。金属元素含有量大于100 mg/kg时，回收率为92.2％～102％；在1～100 mg/kg之间时，回收率为92.8％～104％；在0.1～1 mg/kg之间时，回收率为94.7％～100％；小于0.1 mg/kg时，回收率为85.8％～100％，并且各元素RSD均较小，表明该方法能满足分析要求，具体见表4。

表3　加样回收率试验结果（n=3）Tab.3 Results of recovery tests（n=3）

表4　质控样品检测结果Tab.4 Determ ination results of quality control samples

3.2 样品检测结果 对3批蛹虫草菌丝体干粉中12种金属元素的含有量进行检测，结果见表5，发现均符合中药或食品相关限量指标［16］。

表5　样品检测结果Tab.5 Determ ination results of samp les

4 讨论

近年来，我国环境重金属污染形势严峻，对野生中药材的安全使用构成极大威胁［18-19］。现有研究结果表明，环境中的重金属可通过食物链的传递，经多渠道被人体摄入、蓄积，并引发健康危害效应［20-21］。国内外对中药材的安全性评价高度重视，以其所含金属的总含有量进行评价，并对几种毒性较大的铅、砷、镉、汞元素制定了严格的限量标准，但对常见金属元素含有量的控制及评价研究相对较少，不利于提高中药材质量的总体控制水平。

蛹虫草属真菌类中药材，能富集环境中的重金属元素［5-6］，其所含重金属的含有量可影响药用活性成分的生物合成，从而改变药效。例如，锌可抑制虫草素及腺苷合成［9］；锰可促进虫草素合成，并抑制腺苷合成［10］；六价铬对部分大型真菌（如秀珍菇、猪肚菇）的菌落直径以及菌丝体干重有先增后减的作用［22］，但对蛹虫草生长作用的研究相对较少。蛹虫草因富含超氧化物歧化酶（SOD）而具有抗炎、抗氧化等功效，根据金属辅基不同，主要分为3种，即Cu/Zn SOD、Fe-SOD、Mn-SOD。杜琳等［23］指出，深层发酵蛹虫草菌丝体中主要是Cu/Zn SOD型，但鲜有其对铜的富集作用，以及对活性SOD合成影响的研究。其他金属元素（如铁、镍、锑、钡、银等）都曾被报道存在一定的生态风险［24-28］，但其与蛹虫草相互作用的研究还比较欠缺。现有的元素分析手段大多为单元素测定，检测技术的制约是导致目前研究效率低下的重要原因之一，故迫切需要建立一种效率高、准确度好的多元素同时测定方法。

电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）技术是一种多元素痕量分析技术，相对于光谱法，其具有抗干扰能力强、检测限低、灵敏度高、线性范围宽等优点，可应用于不同类型药品的检测与质量控制［16，29-32］。本实验选择湿法消化结合ICP-MS仪，对蛹虫草菌丝体干粉进行重金属元素含有量分析，检测效率高，消化效果好，可操作性强。结果，蛹虫草菌丝体干粉中锰、锌、铁、铜、钡等元素的含有量较高，这与文献报道其富含硒、锌、锰等元素的特性一致，而且该方法的准确度、精密度等指标都符合检测技术要求。查阅相关限量标准发现，蛹虫草中金属元素的含有量符合国内中药或食品相关限量规定，也符合美国药典标准。

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［饮片炮制］

Determ ination of twelvemetal elements in dry powder of CordycePsm ilitaris m ycelium by ICP-MS

WANG Jing1， HUANGWei-xiong1， LIANG Xiao-yan2， HU Jun-gao1， LIANG Xu-xia1 *
（1.Guangdong p rovincial Center for Diseasep revention and Control，Guangzhou 511430，China；2.RuiKang HosPital Affiliated to GuangxiUniversity of Chinese Medicine，Nanning 530011，China）

ABSTRACT：AIM To establish an inductively coupled plasma-mass spectrometry（ICP-MS）method for determing the contents of Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，As，Ag，Cd，Sb，Ba and Pb in dry powder of CordycePsmilitaris mycelium.METHODS After the sampleswere treated with wet digestion，the contents of twelvemetal elements were determined by ICP-MS.RESULTS The detection limits of twelvemetal elements were low，whose correlative coefficientswere allmore than 0.999 2.Themethod validation was performed on frozen-beech leaf powder and tea leaveswith good accuracy and precision.CONCLUSION All themetal elements in dry powder of CordycePs militaris mycelium accord with related national standards.

KEY WORDS：CordycePsmilitaris mycelium；dry powder；metal elements；ICP-MS

*通信作者：梁旭霞（1972—），女，博士生，主任技师，研究方向为化学污染物监测与风险评估。E-mail：liangxuxia@126.com

作者简介：王 晶（1984—），男，硕士生，主管技师，研究方向为元素分析毒理学。E-mail：wjgdcdc@126.com

基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2015214）

收稿日期：2015-11-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.025

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）05-1083-05