减阻剂改善自发性高血压大鼠左心室重塑

陈海滨　张新禄　梁鸿彬　刘雪薇　修建成

(南方医科大学南方医院心内科，广东　广州　510515)



·基础研究·

减阻剂改善自发性高血压大鼠左心室重塑

陈海滨张新禄梁鸿彬刘雪薇修建成

(南方医科大学南方医院心内科，广东广州510515)

〔摘要〕目的探讨静脉应用减阻剂(DRP)对自发性高血压大鼠(SHR)左心室重塑的影响。方法24只8周龄雄性SHR随机分为3组：生理盐水组(SHR+NS)，减阻剂浓度10 ppm组(SHR+10)和减阻剂浓度20 ppm组(SHR+20)，隔日予静脉注射DRP 或NS,8只年龄匹配的雄性Wistar(WR+NS)大鼠作为对照组予静脉注射NS。静脉给药60 d后，超声心动图评估四组大鼠心功能改变与左心室后壁厚度。分离大鼠左心室心肌，石蜡包埋，HE染色评估左心室心肌肥厚，masson染色评估心肌纤维化，免疫化学检测左室心肌内皮素(ET)-1表达。结果超声心动图显示4组大鼠左心室射血分数无统计学差异，SHR+10组和SHR+20组较SHR+NS组左室收缩末期后壁厚度显著减小；SHR+20组较SHR+NS组左室舒张末期后壁厚度显著减小。左心室心肌HE染色示SHR+20组心肌细胞横截面积较SHR+NS组显著减小。左心室心肌masson染色示SHR+10和SHR+20组较SHR+NS组心肌胶原纤维百分比显著减少。左心室心肌免疫组化显示，静脉应用DRP后，SHR+10、SHR+20组左心室心肌ET-1蛋白表达较SHR+NS组显著降低。结论静脉应用DRP可改善SHR左心室重塑，其机制可能与DRP增加血液剪切应力抑制ET1表达有关。

〔关键词〕减阻剂；心室重塑；内皮素-1；自发性高血压大鼠

心脏重塑的定义为基因表达导致分子、细胞及间质改变，临床表现为心肌肥厚、纤维化和心脏失代偿。其中心室肥厚是高血压患者死亡的独立危险因素，逆转心肌肥厚可以减少患者的心血管并发症。内皮素(ET)-1主要由内皮细胞释放，作用于分布于心脏、主动脉和脑血管平滑肌细胞的ETa受体,介导血管收缩、平滑肌细胞增生和心钠素的分泌，参与细胞外基质合成过程。研究表明〔1〕高血压患者内皮细胞释放ET-1增加，血管及心脏ET-1基因表达上调，促进心肌肥厚与纤维化。提高血液流动剪切应力可以改变内皮细胞排列及结构，并可以抑制ET-1表达。减阻剂(DRP)可以显著改变血液的流体动力学，提高血液流动的剪切应力〔2〕。本文观察静脉应用DRP对自发性高血压大鼠(SHR)左心室重塑的影响。

1材料与方法

1.1实验动物与试剂健康雄性SHR 24只,8周龄，体质量180～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。8只年龄性别匹配的Wistar大鼠，体质量180～220 g，购于南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2011-0015。大鼠均喂食标准饲料，饲养在南方医院实验动物中心恒温、恒湿、人工光照明暗各12 h 的安静饲养室内。DRP聚氧化乙烯(PEO)购于美国Sigma公司，苏木精伊红染色(HE)试剂盒及masson 染色试剂盒购于尚鸿生物科技有限公司，大鼠ET-1一抗购于英国Abcam公司。

1.2动物分组及干预SHR随机分为三组：生理盐水(NS)组(SHR+NS),DRP浓度10 ppm组(SHR+10)和DRP浓度20 ppm组(SHR+20)，8只年龄匹配的雄性Wistar(WR+NS)大鼠为对照组予静脉注射NS。适应性喂养3 d后，隔日用微量泵于尾静脉以3 ml/h速度输注DRP或NS 30 min， 连续给药60 d。

1.3减阻剂的制备精确称取50 mg PEO加入25 ml NS，配制成浓度为2 000 ppm的溶液，将配好的PEO 溶液装入分子截留量为50 000 D的透析袋中，于生理盐水中透析24 h，用生理盐水将透析后的溶液稀释为10及20 ppm两种浓度,最后采用孔径0.2 μm 的滤膜过滤除菌后存放于4℃冰箱备用。

1.4超声心动图评估大鼠心功能改变与左室重塑静脉给药60 d后，实验大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，将大鼠固定于实验台上后，给予左胸备皮，应用配备高分辨率系统的Sequoia512(Acuson,Siemens)超声机，并使用17L5 probe( Acuson,USA)探头，将超声探头定位于前胸产生最佳的胸骨旁短轴二维影像处，在乳头肌水平记录胸骨旁心脏短轴M型超声图像，每只大鼠重复2遍测量取平均值，记录左室收缩末期直径(LVESD)、左室舒张末期直径(LVEDD)、左室收缩末期后壁厚度(LVPWS)和左室舒张末期后壁厚度(LVPWD),计算大鼠左室缩短分数(LVFS)〔LVFS = (LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100%〕及大鼠左室射血分数(LVEF)〔LVEF=(左室舒张末期容积-左室收缩末期容积)/ 左室舒张末期容积× 100%〕。

1.5左心室心肌病理切片及免疫组织化学染色每组随机取4只大鼠分离左心室心肌，放入4℃冰箱中预冷的NS中漂洗干净血渍，于滤纸上轻压吸水后，标记后投入10%中性甲醛溶液固定48 h，而后进行石蜡包埋，制成4 μm厚的切片，进行HE染色、masson染色及免疫组织化学实验，中性树胶封固。在OLYBAS显微镜下观察采集各个切片放大400倍图像数张，并用Image-Plus 6.0专业图像分析软件并测量。

1.6统计学方法应用SPSS13.0软件行单因素方差分析、Welch校正检验Bonferroni检验及DunnettT3检验。

2结果

2.1DRP可显著改善SHR大鼠左室后壁肥厚超声心动图示SHR+10和SHR+20组较SHR+NS组LVESD〔(3.22±0.22)mm，(3.19±0.16)mm vs(2.33±0.13)mm,P<0.05〕、LVEDD〔(6.19±0.23)mm,(5.94±0.17)mm vs(5.38±0.17)mm,P<0.05〕显著增加,LVPWS显著降低〔(2.65±0.12)mm，(2.63 ±0.14)mm vs(3.31±0.21)mm,P<0.05〕；SHR+20组较SHR+NS组LVPWD〔(2.03±0.14)mm vs(2.58±0.048)mm,P<0.05〕显著减低。SHR+10组〔(2.19±0.11)mm〕与SHR+NS组无明显差异，WR+NS组LVESD〔(3.67±0.18)mm〕、LVEDD〔(6.75±0.19)mm〕、LVPWS〔(2.62±0.15)mm〕及LVPWD〔(1.91±0.11)mm〕与SHR+NS组均有明显差异(P<0.05)，而WR组和SHR各组间LVFS〔WR+NS组(0.16±0.03)，SHR+NS组(0.56±0.03)，SHR+10组(0.48±0.03)，SHR+20组(0.46±0.03)〕及LVEF〔WR+NS组(0.76±0.03)，SHR+NS组(0.86±0.03)，SHR+10组(0.78±0.03)，SHR+20组(0.76±0.03)〕无差异(P>0.05)。见图1。

2.2DRP可显著改善SHR左心室心肌肥厚SHR+20组心肌细胞横截面积较SHR+NS组明显下降〔(291.72 ±29.08)μm2vs(630.97 ±54.15)μm2,P= 0.016〕。SHR+NS组较WR+NS组〔(309.34±9.91)μm2〕心肌细胞横截面积显著增加，而SHR+10组和SHR+20组与WR+NS组心肌细胞横截面积无统计学差异。见图2。

图1　超声心动图评估大鼠心功能及左心室室壁厚度

图2　各组大鼠左心室心肌HE染色(×400)

2.3DRP可显著SHR压大鼠左室心肌纤维化心肌masson三色染色示SHR+10和SHR+20组较SHR+NS组心肌胶原纤维百分比显著减少〔(2.70 ±0.34)%，(2.38 ±0.34)% vs(6.58 ±0.49)%,P< 0.05〕，其中SHR+20组较SHR+10组对心肌肥大的抑制效果更强，但两组之间并没有统计学差异。SHR+NS组较WR+NS组〔(1.86±0.37)%〕心肌胶原纤维百分比显著增加(P<0.05)。而SHR+10和SHR+20组较WR+NS组心肌胶原纤维百分比无显著差异。见图3。

2.4DRP可显著抑制SHR大鼠左心室心肌ET-1表达ET-1在4组大鼠左心室心肌均有表达，SHR大鼠左心室心肌表达明显高于WR大鼠。经过静脉应用DRP后，SHR+10组、SHR+20组左心室心肌ET-1表达较SHR+NS组显著降低；SHR+20组较SHR+10组ET-1表达显著减少。见图4。

图3　各组大鼠左心室心肌masson染色(DAB,×400)

图4　各组大鼠左心室心肌ET-1表达(DAB，×400)

3讨论

心肌细胞是参与心脏重塑过程中的主要细胞，其他的成分包括间质、成纤维细胞、胶原和冠状动脉血管。临床表现为左心室肥厚和心脏扩大，其相应的组织学改变主要为心肌细胞肥大和间质纤维化，其中左心室肥厚是高血压的早期改变，随着心肌肥大引起的肌纤维重构排列紊乱、心肌收缩功能障碍，必然进一步发展为心力衰竭。左心室肥厚是引起心力衰竭不断加重的病理生理基础，是导致患者心血管事件发生率显著增加的独立危险因素，与高血压的预后密切相关。

高血压是内皮损伤的始动因素之一，内皮功能紊乱又可促进高血压的发生与进展。研究表明〔3〕，在高血压状态下，主要表现为内皮依赖性舒张功能减弱和(或)内皮依赖性收缩功能增强以及血管壁炎症反应增强等。ET-1参与许多疾病,包括高血压、动脉粥样硬化或纤维化的病理过程〔4〕。高血压患者内皮细胞释放ET-1增加，血管及心脏ET-1基因表达上调，增加的ET-1又可进一步升高血压，促进心肌肥厚与纤维化〔5～7〕。

近年来，国内外学者逐渐开展了DRP在医学领域的应用研究，初步结果显示，静脉应用DRP后可显著减低血流阻力，明显增加组织器官微循环的血流灌注，对于缺血性心血管疾病、失血性休克、脑卒中、糖尿病等的治疗有重要的潜在价值〔8～10〕。本实验室前期研究证实，静脉应用DRP后可显著增加大鼠腹主动脉血流速度，而不影响黏度，由公式计算可得主动脉内血液流动剪切应力显著增加〔11〕。静脉应用DRP后血流剪切应力增加,抑制ET-1表达减弱了ET-1对SHR心肌肥厚的刺激，ET-1通过调节胶原纤维合成及基质金属蛋白酶(MMPs)/组织MMP活性刺激纤维化过程〔12〕，使SHR大鼠左心室心肌纤维化被显著抑制。综上所述，静脉应用DRP通过增加血液流动的剪切应力抑制ET-1表达，显著改善了左心室重塑，为DRP在心血管病治疗上的应用提供理论依据。

4参考文献

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〔2015-12-09修回〕

(编辑袁左鸣)

Drag-reducing polymers improving left ventricular remodeling in spontaneous hypertensive rats

CHEN Hai-Bin,ZHANG Xin-Lu,LIANG Hong-Bin,et al.

Department of Cardiology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of drag-reducing polymers (DRP) on the hypertension-induced left ventricular remodeling in spontaneous hypertensive rats (SHR).Methods24 male SHR were randomly divided into three groups,8 male,age matched Wistar rats (WR) were selected as control.SHR received intravenous injection of normal saline (SHR+NS),DRP of 10 ppm (SHR+10) and DRP of 20 ppm (SHR+20),respectively.WR in the control group only received equal-volume of normal saline (WR+NS).After 60 days,echocardiography was used to evaluate cardiac function and left ventricular remodeling in SHR.The cross-sectional areas of cardiomyocytes and collagen volume fraction in left ventricle were quantified from each group.The expression of endothelin (ET)-1 of left ventricle was examined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the SHR+NS group,left ventricular end-systolic posterior wall thickness (LVPWS) was decreased in SHR+10 and SHR+20 group.Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness (LVPWD) in SHR+20 was attenuated compared with SHR+NS group.The cross sectional areas of left ventricular cardiomyocytes in SHR+20 were attenuated compared with SHR+NS.The collagen volume fraction in left ventricle of SHR+10 and SHR+20 were decreased compared with SHR+NS.The expression of ET-1 in left ventricle of SHR+10 and SHR+20 were significantly attenuated compared with SHR+NS after DRP administration.ConclusionsChronic treatment with DRP can protect against left ventricular remodeling in SHRs.

【Key words】Drag reducing polymers；Left ventricular remodeling；Endothelin-1；Spontaneous hypertensive rats

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81470598)

通讯作者：修建成(1974-)，男，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事冠心病的临床与基础研究。

〔中图分类号〕R541.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2049-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.001

第一作者：陈海滨(1989-)，男，硕士，主要从事冠心病的临床与基础研究。