携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

鄢雪敏撖子建蔡琰余展鹏黄元姣，

作者单位：530021 南宁1广西医科大学生物化学与分子生物学教研室；2广西医科大学医学科学实验中心

基础研究

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

鄢雪敏1撖子建2蔡琰1余展鹏1黄元姣1，2

作者单位：530021 南宁1广西医科大学生物化学与分子生物学教研室；2广西医科大学医学科学实验中心

目的 构建携带绿色荧光基因的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A，并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的EBV潜伏膜蛋白2A（latentmembrane protein 2A，LMP2A）序列，并定向克隆入pIRES2-Zs-Green1载体，双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A；通过脂质体转染将重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞（实验组），同时另设转染pIRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率，RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果 双酶切及测序鉴定证实真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功，荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光，实验组细胞转染率约为75%；RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达，但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论 成功构建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞，目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。

鼻咽肿瘤；EBV潜伏膜蛋白2A；序列克隆；pIRES2-Zs-Green1载体；p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体；基因转染；基因表达

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）是一种线性、双链DNA病毒。EB病毒感染的恶性肿瘤与潜在的感染形式有关，其编码的潜在蛋白可间接引起细胞转化。潜伏膜蛋白2A（latentmembrane protein 2A，LMP2A）是一种由EB病毒编码的致瘤蛋白，可在感染的潜伏细胞表面形成一个贴片，亦可在细胞核周围形成［1］。研究发现，LMP2A会导致EB病毒的持续感染［2］。而多项研究表明，原发瘤和转移瘤中LMP2A的RNA均表达，提示LMP2A可能是EB病毒感染的肿瘤发展过程中的一个趋化因子，而EB病毒编码的LMP2A蛋白因致瘤性被广泛研究［3～5］。本实验将从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的LMP2A序列，以构建带绿色荧光标记的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A，并将其转染至鼻咽癌CNE2细胞，为研究EBV-LMP2A在鼻咽癌细胞中的表达及其促进鼻咽癌发生、发展的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞 EBV阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8细胞株由本实验室保存，从该细胞株中克隆LMP2A序列。鼻咽癌CNE2细胞株由中南大学湘雅中心实验室细胞库提供。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养液，置于37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱内培养。每天更换培养液，观察细胞生长状况，2～3 d后对长势良好且铺满瓶底95%左右的细胞传代1次。

1.1.2 载体与试剂 真核表达绿色荧光蛋白载体pIRES2-Zs-Green1由本实验室保存，T载体试剂盒购自北京全式金生物公司。TriPure购自Roche公司，逆转录试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、高保真酶（PrimeSTAR Max DNA Polymerase）、T4 DNA连接酶、预混Taq酶（Premix Taq）、快切酶Quick CutNheI、Quick CutEcoRI均购自大连宝生物（TAKARA）公司。大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物公司，Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 LMP2A序列扩增 根据GeneBank数据库中LMP2A序列设计PCR引物，上游引物为5′-AAGCTAGCCACCATGTCTGATAATGGACCCCAATCAA-3′，下游引物为5′-GAATTCTTATGCCTGAGTTGAATCAGCAGAA-3′。在上游引物中引入Nhe I酶切位点（划线部分），同时引入冈崎片段CACC序列以易于真核细胞表达，在下游引物引入Eco R I酶切位点（划线部分），引物由深圳华大基因合成。按照试剂盒说明书从EBV阳性的狨猴淋巴瘤细胞 B95-8提取细胞总RNA，将总RNA按照逆转录试剂盒逆转录为cDNA。建立高保真酶PCR体系，按照设计的引物设置PCR条件，对目的序列进行PCR扩增。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃后延伸5 min。回收PCR产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳以检测目的产物分子量大小，回收纯化LMP2A片段。

1.2.2 真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A的构建及鉴定 取上述回收纯化的LMP2A片段3μL，Premix Taq酶1μL，72℃条件下保温20 min。按照pEASY-T1 Simple Kit说明书加入pEASY-T1 Simple载体1μL，37℃条件下进行20min连接。扩大培养含有目的质粒的工程菌，然后提取工程菌中LMP2A的TA克隆质粒。用Nhe I、Eco R I酶处理pIRES2-Zs-Green1载体和LMP2A的TA克隆质粒，回收线性p IRES2-Zs-Green1载体片段和LMP2A片段，用T4连接酶连接p IRES2-Zs-Green1载体片段和LMP2A片段以构建真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A。将连接产物导入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，抽提质粒，最后双酶切和测序进行鉴定，构建真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A。

1.2.3 真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A转染选取生长状态良好的鼻咽癌CNE2细胞，按细胞浓度为3×105接种于6孔板，当细胞贴壁生长至瓶底80%时进行转染。将真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞（实验组），同时另设转染空载质粒p IRES2-Zs-Green1的阴性对照组及未转染的空白对照组，每组设置3组重复实验。转染步骤按照试剂Lipofec-tamine 3000提供的说明书进行操作。转染12 h后更换新的含10%FBS的RPMI 1640培养基继续培养。

1.2.4 倒置荧光显微镜观察真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A转染情况 转染的鼻咽癌CNE2细胞培养24 h后从培养箱中取出，在Olympus倒置荧光显微镜的普通光路和荧光光路下观察转染后鼻咽癌CNE2细胞中绿色荧光蛋白的表达，每个孔随机选取5个视野（400×）拍照，在普通光路下计算某一视野下的总细胞数，同一视野下荧光光路下计算有荧光表达的细胞数，转染效率=荧光表达细胞数/总细胞数，取5个视野的转染效率平均值，即为鼻咽癌CNE2细胞的转染效率。

1.2.5 RT-PCR鉴定LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达 按照试剂盒说明分别提取实验组、阴性对照组和空白对照组鼻咽癌CNE2细胞总RNA，然后逆转录为cDNA后，以GAPDH为内参，最后用LMP2A扩增引物检测细胞中LMP2A蛋白的mRNA表达，扩增体系和条件同前，以DNA Marker为参照，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小。

2 结果

2.1 LMP2A序列扩增

从EBV阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8提取总RNA，利用PCR扩增出LMP2A基因序列，1%琼脂糖凝胶电泳确定扩增目的序列分子量。电泳结果显示，扩增的目的基因LMP2A条带清晰，分子量大小约为1 494 bp，与预计相符。见图1。

图1 LMP2A序列扩增

2.2 真核表达载体p IRES2-Zs-Grenn1-LMP2A的构建与鉴定

从真核表达载体p IRES2-Zs-Grenn1-LMP2A转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中抽提质粒，然后分别进行Nhe I单酶切、Eco R I单酶切以及Nhe I、Eco R I双酶切，在第4泳道，约为1 494 bp处可见一条带，即为目的基因LMP2A（见图2）。把酶切鉴定正确的质粒进行DNA测序，通过NCBI中的序列比对工具BLAST，将测得的序列与设计的基因序列进行比对，结果提示二者一致（见图3），说明成功构建了真核表达载体p IRES2-Zs-Grenn1-LMP2A。

图2 双酶切鉴定p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体

图3 p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体测序结果比对

2.3 p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体的转染及绿色荧光蛋白的表达

利用Lipofectamine 3000脂质体转染试剂将pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体转染至鼻咽癌CNE2细胞，培养24 h后观察细胞中的绿色荧光蛋白表达情况。荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光，其中实验组细胞转染效率约为75%，说明真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A可在鼻咽癌CNE2细胞中正常表达。见图4。

图4 p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体转染24 h后绿色荧光蛋白的表达

2.4 RT-PCR检测LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达

RT-PCR检测结果显示，实验组细胞中发现目的基因LMP2A的表达，但阴性对照组和空白对照组细胞中均未检测到目的基因表达，说明p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体成功转染至鼻咽癌CNE2细胞。见图5。

图5 RT-PCR检测LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达

3 讨论

鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一［6］，由于鼻咽解剖部位的隐蔽性及临床症状的多样性，就诊时大部分患者已属中晚期，单纯放疗5年生存率为25%～50%［7］。鼻咽癌的发生、发展与饮食、环境、遗传以及EB病毒感染等有关。常见的病原体EB病毒可转化人B细胞而引起肿瘤，在幼儿时期EB病毒无症状感染人体，在青春期或成年时期约三分之一的EB病毒无症状感染者出现EB病毒感染所致的自限性单核细胞增多综合征［8］。尽管EB病毒与肿瘤发病机制的关系尚未清楚，但有研究发现其可引起淋巴或上皮恶性肿瘤，NK-T淋巴细胞瘤、Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、鼻咽癌等恶性肿瘤均与EB病毒感染密切相关［9，10］。研究发现，在鼻咽癌患者血浆中常检测到EB病毒衣壳抗原-抗体（EBV-VCA-lgA）且较正常人升高，认为检测EBV-VCA-lgA在血清中的表达水平，有助于初步筛选、辅助诊断鼻咽癌［11］。

LMP2A蛋白是由一个长N-末端、12个跨膜结构域和一个短C-端组成，可在感染的潜伏细胞表面形成一个贴片，亦可在细胞核周围形成［1］。LMP2A的N-末端包含与其他蛋白分子交流所必需的8个磷酸化酪氨酸残基和7个脯氨酸域［4］，在B细胞和上皮细胞中能够通过AKT通路激活磷酸肌醇-3激酶［12～14］，在人类胃癌细胞系HSC-39中可激活非依赖型锚细胞生长［15］。同时LMP2A是一种EB病毒编码的致瘤蛋白，可通过激活宿主细胞相关信号通路促进细胞转化和生长［14～16］。近年来EB病毒编码的LMP2A蛋白因其致瘤性被广泛研究。本课题组前期从EBV阳性的B95-8细胞中成功扩增出LMP1序列，并在鼻咽癌CNE1、CNE2细胞中表达［17］，为本研究提供了重要的参考。本实验选取EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8克隆EB病毒编码的LMP2A序列，在克隆LMP2A序列实验中，基于前期成熟的克隆条件和实验技术，电泳结果显示，扩增的目的基因LMP2A条带清晰，分子量大小约为1 494 bp，与预计相符。而进一步将构建好的p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体进行双酶切以及测序检测克隆的LMP2A片段，结果证实测序结果与克隆出的序列一致，说明克隆实验结果可信，成功构建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体，为后续细胞实验提供了实验基础。

p IRES2-Zs-Green1载体是一种在表达目的蛋白的同时可表达绿色荧光蛋白的载体，本研究在绿色荧光蛋白标记的p IRES2-Zs-Green1载体中定向插入目的序列LMP2A，将构建的p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体转染鼻咽癌CNE2细胞。在荧光显微镜下可见转染p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体组和转染pIRES2-Zs-Green1载体的细胞均发出绿色荧光，通过p IRES2-Zs-Green1载体的绿色荧光蛋白表达观察实验组细胞转染效率，结果显示其转染效率较高，约为75%，说明pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体可在鼻咽癌CNE2细胞中正常表达。同时，采用RT-PCR检测LMP2A基因在鼻咽癌CNE2细胞中的表达，结果显示，实验组细胞发现目的基因LMP2A的表达，但阴性对照组和空白对照组细胞中均未检测到目的基因表达，说明p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体成功转染至鼻咽癌CNE2细胞。

综上所述，本研究成功构建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体，并将其成功转染鼻咽癌CNE2细胞，为后续研究LMP2A蛋白在鼻咽癌细胞行为学及分子机制中的作用奠定了实验基础。

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［2016-06-23收稿］［2016-07-25修回］［编辑 罗惠予］

Construction of an EBV-LMP2A eukaryotic expression plasm id with a green fluorescent protein reporter and transfection into nasopharyngeal carcinoma cells

Yan Xuemin1，Han Zijian2，Cai Yan1，Yu Zhanpeng1，Huang Yuanjiao1，2（1Biochemistry and Molecular Biology Department of Guangxi Medical University；2Experiment Center of Medical Science，GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Huang Yuanjiao.E-mail：hyjgxmu@126.com

objective To construct the eukaryotic expression plasmid p IRES2-Zs-Green1-LMP2A encoding green fluorescent protein，and to transfect it into CNE2 nasopharyngeal carcinoma cells.M ethods The LMP2A sequence from EBV-positive B95-8 cells was cloned into the vector p IRES2-Zs-Green1.The identity of the resulting pIRES2-Zs-Green1-LMP2A was confirmed using restriction enzymes and sequencing.The expression plasmid was transfected into CNE2 cells using a liposome-based method.The resulting transfectants were compared with negative controls transfected with p IRES2-Zs-Green1 and with untransfected cells in terms of expression of green fluorescent protein and LMP2A transcription.Results Restriction enzyme digestion and sequencing showed that pIRES2-Zs-Green1-LMP2A was constructed successfully.Transfection of pIRES2-Zs-Green1-LMP2A or empty vector p IRES2-Zs-Green1 led to expression of green fluorescent protein，and fluorescence microscopy indicated transfection efficiency of approximately75%.Only cells transfected with the complete plasmid p IRES2-Zs-Green1-LMP2A produced LMP2A mRNA.Conclusion The eukaryotic expression plasmid p IRES2-Zs-Green1-LMP2A has been successfully constructed，and it can drive steady expression of LMP2A in CNE2 cells，making this system useful for studies of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal neoplasm；EBV latentmembrane protein 2A；Sequence clone；Vector p IRES2-Zs-Green1；Eukaryotic expression vector p IRES2-Zs-Green1-LMP2A；Gene transfection；Gene expression

R739.6

A

1674-5671（2016）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.04.02

国家自然科学基金资助项目（81260405）；广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室基金项目（GK2013-A-02-02）

黄元姣。E-mail：hyjgxmu@126.com