酵母对浓香型白酒糟醅中高级醇生成的影响

游玲，任羽，王涛，杨志荣*

1(四川大学 生命科学学院，四川 成都，610065)　2(宜宾学院 生命科学与食品工程学院，固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644000)



酵母对浓香型白酒糟醅中高级醇生成的影响

游玲1，任羽2，王涛2，杨志荣1*

1(四川大学 生命科学学院，四川 成都，610065)2(宜宾学院 生命科学与食品工程学院，固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644000)

摘要为探究浓香型白酒酵母对混菌发酵糟醅中高级醇生成的影响，将24株分离自浓香型白酒酿造车间的酵母分别接种到未灭菌的液态及固态糟醅中，发酵50 d，检测糟醅中9种高级醇的含量，发现分别仅有1株及4株酵母使固态及液态混菌发酵糟醅中的高级醇生成总量发生显著变化，24株酵母对不同高级醇生成的影响不同，且无种属特异性；与液态混菌发酵糟醅相比，固态混菌发酵糟醅中高级醇的生成受单一酵母菌株的扰动更小，且生成总量较少。结果表明，传统自然固态发酵工艺在弱化外来酵母菌株造成的高级醇生成波动方面起着重要作用。

关键词酵母；高级醇；混菌固态发酵

高级醇是指碳原子数大于2的醇类，白酒中主要是异丁醇、异戊醇、正丙醇、正丁醇等，在水中呈现油状物，所以又叫杂醇油[1]。作为白酒中一类重要的香气物质，高级醇不仅呈香呈味，还是多种酸、酯的前体，但含量超过一定限度，则使酒苦、辣、糙、涩，同时导致饮后上头，影响人体健康。因此，在生产上，人们倾向于通过选用蛋白质含量低的酿酒原料，控制蒸馏条件，减少用曲量，人工催陈等[2-3]方法降低高级醇含量。

酵母与多种高级醇的生成密切相关，在对啤酒酵母产高级醇的相关研究中发现，不同啤酒酵母菌株对啤酒中高级醇的含量影响较大，选育低产高级醇的啤酒酵母用于啤酒生产是控制啤酒高级醇含量的关键[4-5]。白酒发酵过程中，影响高级醇生成的因素更多[6]，其中酵母的生长代谢仍是重要的影响因素[1]，如肖敏等[7]发现，分离自清香型白酒糟醅中的分属于8个属的33株酵母菌均可产生异丁醇和异戊醇，而正丙醇、正丁醇、正戊醇则由不同的酵母菌株产生。有目的地使用酵母可起到显著调节发酵体系中高级醇生成的作用，如通过控制酵母菌生长调控酱香型白酒中杂油醇的生成[8]，通过添加活性干酵母、糖化酶降低浓香型白酒糟醅中高级醇总量[9]。

在啤酒、葡萄酒等纯菌发酵过程中，人们通过多种手段来限制或调节高级醇的生成[10-12]，但在固态混菌发酵状态下，参与高级醇相关代谢途径的微生物众多，在混菌发酵微生物区系形成的复杂共代谢网络中，不同种属酵母除自身代谢产高级醇外，还通过与其他微生物相互作用影响高级醇的生成，而固态发酵进一步增加了代谢产物的复杂性[13]。本研究选取分离自浓香型白酒酿造车间的24株酵母，研究其对固态或液态混菌发酵糟醅高级醇生成的影响，一方面通过浓香型白酒酵母影响白酒高级醇生成的种属或菌株差异，探讨混菌固态发酵条件下酵母群体与体系中高级醇生成的关系；另一方面，筛选到一些与固态发酵工艺条件相适应的，适用于调控发酵体系中高级醇种类及生成量的酵母菌株。

1材料与方法

1. 1材料

供试菌株：分离自川南多家知名浓香型白酒企业酿造车间的24株酵母，经26S rDNA特征序列鉴定，分属于5个属的8个种(结果另文发表)，其中Debaryomyceshansenii酵母8株(G8M-28、H9Y-30、S532Y-32、S632Y-20、S632Y-24、W8Y-4、Z8Y-19、Z8Y-91)，Wickerhamomycesanomalus酵母8株(H4Y-33、H5Y-26、H6Y-19、H9Y-16、S433Y-17、S442Y-9、W8Y-10、Z8Y-23)，Lodderomyceselongisporus酵母2株(W8Y-18、Z9Y-91)，Zygosaccharomycesbailii酵母2株(H1Y-24、 H6Y-22)，Pichiakudriavzevii酵母1株(S432Y-42)，Pichiamanshuricastrain酵母1株(Z4Y-31)，Trichosporonoidesspathulata酵母1株(SZ8Y-2)以及未鉴定到种的Pichia酵母1株(Z8Y-15)。

糟醅为川南某知名多粮浓香型白酒生产企业正常生产的入窖粮糟(添加20%的大曲)，其中酒精含量0.8%vol，黄水为对照窖池上一轮发酵黄水，酒精含量5.1%vol，取样时间2013年12月。

1.2处理方法

菌悬液制备：将酵母纯培养物划线接种在YPD固态培养基上，30 ℃培养48 h，挑取菌落至50 mL无菌水，3 000 r/min离心5 min去除上清液，再重新悬浮洗涤菌体，通过调节添加无菌水的量调整菌悬液OD560值至0.5左右，4 ℃保存备用。

固态发酵：在酿造车间内，24株酵母菌悬液50 mL分别与2.5 kg入窖粮糟、30 mL黄水混合后分装入3个体积为1 L的玻璃坛中(坛口自下而上用灭菌窖泥、坛盖、保鲜膜将坛口封闭)，纯菌固态发酵糟醅中添加10%葡萄糖混匀后经1×105Pa灭菌30 min，再接种对应酵母菌株，29 ℃遮光培养50 d。以等体积无菌水代替菌悬液接种作为空白对照。

液态发酵：在酿造车间内，24株酵母菌悬液15 mL分别与300 g入窖粮糟、30 mL黄水、600 mL蒸馏水混合后装填入3个体积为1 L的三角瓶中(瓶口自下而上用保鲜膜将瓶口封闭)，纯菌液态发酵为上述每个三角瓶中再另加入10 g葡萄糖，1×105Pa灭菌30 min后接种对应酵母菌株，50 r/min振荡培养10 h后，29℃遮光培养50 d。以等体积无菌水代替菌悬液作为空白对照。

1.3分析检测

固态发酵糟醅混匀后取100 g糟醅，加入200 mL无菌水，液态发酵样品摇匀后直接取300 mL发酵液，200 mbar、150 r/min、80 ℃条件下分别蒸馏出100 mL蒸馏液，0.22 μm过滤后GC检测，使用郑州谱析公司生产的Lzp930色谱柱(30 m×0.32 μm)，载气为高纯氮气，50 ℃保持3 min，以5 ℃/min 的速率升温至150 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升温至190 ℃，保持5 min，最后以3 ℃/min 的速率升温至220 ℃，保持10 min；进样温度220 ℃，进样量0.2 μL，分流比20∶1。标样采用郑州谱析公司提供的9种高级醇混合标样。

所得数据采用SPSS19. 0进行显著性及相关性分析。

2结果分析

2.1酵母对液态发酵糟醅中高级醇生成的影响

由表1可知，24株酵母中仅有4株对液态混菌发酵糟醅中高级醇的生成总量有显著影响，其中菌株S632Y-20与S442Y-9显著降低了液态糟醅中的高级醇含量，菌株G8M-28、H6Y-22显著促进了液态糟醅中高级醇的生成；11株酵母对混菌液态糟醅中1种以上高级醇造成显著影响。但在液态灭菌糟醅中，酵母对高级醇生成的影响更大，15株酵母显著影响其中的高级醇生成总量，且与空白对照相比，波动幅度在4.8%～5 409.5%；16株酵母可使至少1种高级醇的生成总量发生显著变化，表明酵母与液态混菌体系中微生物群体间的相互作用削弱了酵母对高级醇生成的直接影响。

表1　酵母对液态发酵糟醅中高级醇生成的影响　单位：g/L

续表1

酵母菌株正丙醇仲丁醇异丁醇正丁醇异戊醇糠醇苯甲醇3-甲硫基丙醇β-苯乙醇未灭菌液态糟醅高级醇总量灭菌液态糟醅高级醇总量W8Y-40.9810.0960.4551.82*1.3630.1060.01700.2875.1560.114*Z8Y-151.4590.0780.5211.0961.7250.1530.0190.0200.3105.1260.332*S433Y-171.3280.0730.4751.5311.4810.1270.0210.0230.3605.3810.069*S632Y-240.8860.0920.5681.801*1.5160.0920.0200.0300.5235.4190.022Z8Y-231.8880.0810.5031.0811.6720.1620.01400.2755.5280.054S432Y-421.8530.0840.5110.7581.8040.1960.0150.0310.5145.6760.074*SZ8Y-22.1390.0840.5680.7951.9460.2200.0160.0170.1835.7660.071*W8Y-101.1780.0790.4862.025*1.3980.1340.0160.080*0.5715.9680.174*Z8Y-192.0820.0940.5781.0271.8630.2170.010*00.2445.9670.050H1Y-241.4120.0970.5752.111*1.6470.1360.0180.0300.160*6.1160.206*Z9Y-912.1030.0920.5981.6151.960.1820.01400.160*6.1860.135*G8M-282.5890.1050.6231.5822.1880.268*0.01400.2086.724*0.253*H6Y-223.142*0.1160.781*1.3222.712*0.298*0.0200.0260.2617.578*1.136*平均值1.4490.0910.4961.1051.5520.1550.0170.0200.3684.8020.194空白1.7570.0860.4530.8081.4720.1090.0260.0290.4155.1560.021平均增幅/%-17.55.79.636.75.441.6-36.1-30.3-11.3-4.6823.2

注:*表示差异显著(P<0.05)。

酵母在液态发酵糟醅中纯菌发酵主要产正丁醇及异戊醇(数据未列出)，这与肖敏等的研究一致[7]，但接种24株酵母的液态混菌发酵糟醅高级醇的平均生成总量仅比空白增加2.8%，其中糠醇的增幅最大(41.6%)，其次是异丁醇(9.6%)、仲丁醇(5.7%)、异戊醇(5.4%)，正丙醇、苯甲醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇生成量明显下降，表明混菌液态发酵糟醅中，酵母对不同种类高级醇生成的影响更加复杂。

2. 2酵母对固态发酵糟醅中高级醇生成的影响

由表2可知，12株酵母接种灭菌固态糟醅后使其中高级醇的生成总量发生显著变化，变化幅度在19.2%～1 851.2%，但仅有1株酵母(Z9Y-91)可使混菌固态发酵糟醅中高级醇的生成总量显著增加，增幅为80.1%，波动幅度也较小。同时，接种不同酵母菌株的灭菌糟醅中高级醇的生成量差异极大，H5Y-26菌株可使灭菌糟醅中高级醇的生成量增加18.5倍，而S632Y-20使其中高级醇的生成量降低至空白的17.4%，但接种这2株酵母的未灭菌糟醅中高级醇的生成量均接近空白对照，表明与液态发酵类似，混菌发酵削弱了酵母对固态发酵糟醅中高级醇生成的影响。

表2　酵母对固态发酵糟醅中高级醇生成的影响　单位：g/kg

续表2

酵母菌株正丙醇 仲丁醇 异丁醇 正丁醇 异戊醇 糠醇 苯甲醇 3-甲硫 基丙醇 β-苯乙醇 未灭菌固态糟醅高级醇总量灭菌固态糟醅高级醇总量S432Y-420.3540.0660.1330.0500.3670.1850.0230.0440.0541.2761.978*H9Y-30-20.4040.0980.1390.0610.3740.1750.0180.0240.0421.3350.366Z4Y-310.3530.0750.1800.0440.4770.1400.0200.0100.0511.3501.002*Z8Y-910.3840.0880.1620.0690.4450.1130.0180.0150.0711.3651.223*S442Y-90.4010.1010.1700.0600.4550.0990.0270.0190.0541.3860.236H6Y-190.3390.0580.1690.0610.4320.2170.0220.0160.0771.3911.283*S632Y-240.463*0.1020.1690.0620.4900.1370.0220.0080.0321.4850.335W8Y-18-10.4360.110*0.1710.0630.4550.1430.0220.0140.0581.4720.084S532Y-320.4380.0980.1900.0550.4820.1360.0230.0120.0621.4960.263Z8Y-150.259*0.0730.1970.0421.022*0.1330.0160.0060.0271.7751.269*Z9Y-910.4480.0870.204*0.0610.5150.1600.652*0.0140.117*2.258*0.207平均值0.3570.0760.1500.0540.4210.1430.0460.0140.0591.3211.428空白0.3610.0680.1500.0500.3900.1630.0230.0060.0431.2540.453平均增幅/%-1.212.40.37.88.0-12.5100.9136.138.05.3215.3

注:*表示差异显著性(P<0.05)。

从不同高级醇的增幅来看，苯甲醇及3-甲硫基丙醇的增幅最大，均超过100%，表明酵母对这两种高级醇的生成有一定促进作用，其次是β-苯乙醇，而正丙醇及糠醇的生成量下降，与液态混菌发酵糟醅不同的是，固态发酵促进了在高级醇总量中所占比例较少的几种高级醇的生成，使整体风味更加复杂协调。

另一方面，不同酵母对混菌发酵糟醅中不同高级醇生成的影响有明显差异，如在固态混菌发酵糟醅中，S632Y-24及Z8Y-15显著增加正丙醇的生成量，菌株H9Y-16-A及Z9Y-91显著促进β-苯乙醇的生成，表明可通过接种酵母来调控混菌发酵糟醅中不同高级醇的生成量，进而达到调整白酒风味的目的。

另外，从表1、2中还可以看出，无论接种哪一株酵母或是否接种酵母，液态混菌发酵糟醅中高级醇的生成量都高于固态混菌发酵糟醅，表明固态发酵方式可减少高级醇的生成。

图1　接种不同酵母的固态及液态混菌发酵糟醅中的高级醇聚类图Fig.1　Systematical cluster analysis depended on high alcohols in submerged and solid fermentative grain supplemented by 24 yeast strains

以接种24株株酵母的液态及固态发酵糟醅中各类高级醇的含量为聚类指标，分别对24个实验处理进行系统聚类(图1)，发现固态混菌发酵糟醅的25个处理仅聚为4个分支，且其中23个处理被划分到2个主要分支，而液态发酵的25个处理分支数达15个，不同分支间隔也较远，且无论是固态还是液态糟醅，均存在属于同一个种的酵母分布在不同分支，不同种属酵母分布在同一分支的现象，未体现酵母影响高级醇生成的种属特异性，说明发酵方式(固态或液态)对混菌发酵糟醅中高级醇生成的影响大于酵母种属差异，针对外来酵母对混菌发酵体系中高级醇代谢的冲击，固态混菌发酵糟醅较液态更加稳定。这可能是因为固态糟醅环境中界面更丰富，可在其中生长代谢的微生物种类更多，相互之间协同生长、代谢状况更复杂，这可能正是传统白酒发酵多选择固态发酵工艺的部分原因。

并且，接种同一酵母菌株的液态与固态发酵糟醅中高级醇的种类、含量差异也较大，如接种W8Y-4菌株的混菌固态发酵糟醅中糠醇含量显著低于空白，而液态混菌发酵糟醅中糠醇的生成量无明显变化，这进一步印证了酵母对液态及固态混菌发酵糟醅中高级醇生成的影响差异，在图1中则体现为固态发酵聚类在一起的酵母菌株，在液态发酵中相隔甚远，反之亦然。

2.3两种发酵条件下高级醇生成途径的相关性分析

在混菌固态发酵环境下(表3)，正丙醇与正丁醇、异丁醇、仲丁醇的生成、异丁醇与异戊醇的生成、β-苯乙醇与苯甲醇的生成显著相关，可能是由于这些高级醇具有相似的碳架结构及生成途径；而异丁醇与苯甲醇的生成显著相关，其原因尚有待进一步研究。

表3　固态混菌发酵糟醅中不同高级醇生成的相关性

注:*表示差异显著性P<0.05；**表示差异显著性P<0.01(表4与此相同)。

在混菌液态发酵环境下(表4)，与固态相似，C3-C5高级醇相互之间的关联较密切，但仍有明显差异，如正丙醇与异丁醇、异戊醇的生成显著相关，但与仲丁醇的相关性不显著，异丁醇与正丁醇、异戊醇的生成显著相关；同时，β-苯乙醇仅与3-甲硫基丙醇、异戊醇的生成显著相关，与苯甲醇的相关性不显著；差别最大的则是糠醇，固态发酵环境中糠醇的生成与其他高级醇之间缺乏相关性，而在液态发酵环境中，糠醇的生成与正丙醇、仲丁醇、异丁醇、异戊醇这4种高级醇的生成显著相关，表明固态发酵对糠醇的生成途径有明显影响，而异丁醇与正丙醇、异戊醇在两种发酵环境下均呈现显著相关，表明这两组高级醇生成的微生物共代谢途径相对较稳定。

表4　液态混菌发酵糟醅中不同高级醇生成的相关性

3讨论

在白酒生产过程中，添加酵母可提高乙醇的生成量，但是否会影响糟醅中高级醇等风味物质的生成，人们一直心存疑虑。基于本研究的实验结果，关于酵母对混菌发酵糟醅中高级醇生成的扰动，本研究可得出以下3点主要结论：(1)不同酵母对固态或液态混菌发酵糟醅中高级醇生成的影响不同，仅少数酵母菌株对高级醇生成总量有显著影响；(2)固态混菌发酵比液态混菌发酵更明显地削弱了外来酵母对高级醇生成的影响；(3)对混菌发酵体系来说，与外来酵母菌株相比，发酵工艺(固态或液态)对混菌体系中高级醇生成的影响更大，传统固态发酵工艺在稳定及调整微生物区系波动造成的影响方面可能起着非常重要的作用。

MANGAS[14]发现，75%的高级醇来自糖代谢途径，25%来自氨基酸代谢途径，而这两种途径均与α-酮酸有关。从两种发酵环境中高级醇的生成差异来看，液态糟醅中高级醇的生成量普遍高于固态糟醅，一方面可能是由于液态发酵糟醅的均质性及流动性使生成的高级醇均匀分散到体系中，解除了反馈抑制，使得高级醇的生成朝着正反应方向进行；但更主要的原因可能是由于液态发酵环境中氧气含量较少，导致累积的α-酮酸不能完全氧化成CO2和H2O，并在酮酸脱羧酶及脱氢酶的作用下进一步生成高级醇[9]，结合郝欣等[15]关于酵母丙酮酸脱羧酶对高级醇的生成无明显影响的报道，我们认为溶氧量对混菌发酵糟醅α-酮酸转化为高级醇的可能更大。同时，由于高级醇的生成还受到氨基酸种类、含量及其相互之间代谢转换关系的影响，因此还可通过监测发酵体系中高级醇、溶氧、氨基酸、α-酮酸及蛋白酶、转氨酶、酮酸脱羧酶等酶活性的变化来进一步分析两种发酵环境中的高级醇代谢途径差异。

另外，本研究还得到数株可减少固态混菌发酵糟醅中高级醇生成，特别是减少某些不良高级醇，如正丙醇(苦涩味)生成的酵母菌株，后续将对这些酵母产乙醇能力、产酸能力、对混菌微生物区系的影响等开展研究，最终用于浓香型或其他香型白酒固态发酵。

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Effects of yeasts on higher alcohols forming in Chinese strong-flavored liquor producing

YOU Ling1REN Yu2WANG Tao2YANG Zhi-Rong1*

1(College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)2(Soild-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China)

ABSTRACTTo explore the effects on higher alcohols forming in fermentative grains of yeast strains associated with the Chinese strong-flavored liquor producing, 24 strains isolated from the fermentation workshop were inoculated to unsterilized solid or submerged fermentative grain and the contents of 9 higher alcohols in both fermentation system were detected after fermentation for 50 d. Results showed that only 1 yeast strain changed the total content of higher alcohol significantly in unsterilized solid and 4 yeast strains changed that in submerged fermentative grain. The different impacts of 24 yeast strains on different higher alcohols were different, while no species specificity was found. Compared with the fermentation in unsterilized submerged fermentative grain, the fluctuation caused by yeast strains was weakened in unsterilized solid fermentative grain, and the total content of 10 higher alcohols was reduced. The results indicated that the technology of traditional natural solid fermentation played an important role in hindering the impacts led by foreign yeasts.

Key wordsliquor yeasts; higher alcohols; mixed solid fermentation

收稿日期：2015-07-13，改回日期：2015-09-14

基金项目：四川省科技厅支撑计划项目(15ZC0141)；四川省教育厅基金项目(15ZB0291)；宜宾学院青年基金项目(2011Z26)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601005

第一作者：博士研究生，助理研究员(杨志荣为通讯作者，E-mail：bioyang@163.com)。