酶法辅助浸提茶叶有效成分

杨刘艳，江和源，张建勇，徐斌，刘千录，王伟伟

1(中国农业科学院茶叶研究所,农业部茶树生物学与资源利用重点实验室,浙江省茶叶加工工程实验室,浙江 杭州,310008)　2(中国农业科学院研究生院, 北京, 100081)



酶法辅助浸提茶叶有效成分

杨刘艳1,2，江和源1*，张建勇1，徐斌1,2，刘千录1,2，王伟伟1

1(中国农业科学院茶叶研究所,农业部茶树生物学与资源利用重点实验室,浙江省茶叶加工工程实验室,浙江 杭州,310008)2(中国农业科学院研究生院, 北京, 100081)

摘要以粒径为0.63 mm的茶叶为原料，比较了不同提取方式对其有效成分浸出效果的影响，并对复合酶辅助提取法进行工艺优化。结果表明，复合酶(纤维素酶和果胶酶)对有效成分的提取效果较好，且条件温和、操作简便。以茶多酚、氨基酸、水浸出物的提取率为响应值，在单因素实验的基础上，运用四因素三水平正交设计优化出浸提工艺条件为：酶解温度50 ℃、酶解时间75 min、酶解pH 5.0、复合酶添加量0.2%。在此条件下有效成分提取率分别为：茶多酚77.79%、氨基酸70.62%、水浸出物83.05%、咖啡碱82.13%。

关键词茶叶；酶法辅助；有效成分；优化

浸提是茶叶深加工的一个关键环节，浸提效率的高低将直接影响茶叶有效成分的得率及产品品质[1]。目前工业生产上应用较多的提取方法是传统高温浸提，虽然提取效率高、时间短，但一些茶叶品质成分在相对高温条件下易聚合形成不溶于冷水的络合物[2-3]。采用冷浸法[4]进行提取，茶叶品质成分的变化小，同时也可减少易溶于热水的部分蛋白质及果胶的浸出[5]，但提取效率相对较低且浸提时间长。利用超声波技术进行提取能够缩短浸提时间，减少溶剂的消耗量[6]，增加浸出物含量，提高浸出速率[7]。

孙庆磊[8]比较了上述3种浸提方式对绿茶主要化学成分浸出的影响，结果表明，超声波对生化成分的提取率高于低温浸提，而与高温浸提接近。随着现代生物技术的不断发展，生物酶在茶叶的提取加工中得到了较好的应用[9]。生物酶能够将植物材料降解成更为疏松的结构，使细胞中的有效成分最大限度地浸出，此外，酶法提取反应条件温和，在降低成本和能耗上具有一定的优势。张卫红等[10]使用纤维素酶及果胶酶提取茶多酚，提取率可达98%以上，儿茶素的相对浸出量较沸水提取高出9%～10%。蒋丽[11]比较了超声波提取、酶法提取、常规提取及超声波协同酶法提取对茶多酚提取率的影响。结果表明，酶法提取与酶法协同超声波提取均能获得较高的茶多酚提取率。但该研究中水解酶仅选用了纤维素酶一个种类 ，未涉及其他水解酶或复合水解酶提取效果的比较。

本研究在上述基础上，增加了复合酶浸提、超声波协同复合酶浸提对茶多酚、氨基酸、咖啡碱、水浸出物等提取效果的比较。并对复合酶提取的酶添加量、时间、温度、复配比及pH等因子进行筛选，进一步优化酶解工艺技术参数，以期为生物酶提取技术在茶叶深加工中的应用提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

鲜叶原料，采自广东，采摘标准为一芽2、3叶，采摘后不经杀青、揉捻工序，以120 ℃直接烘干。磨碎后过筛，选粒径为0.63 mm茶样备用。

纤维素酶(44 000 U/g)、果胶酶(>30 000 U/g)，购自绵阳禾本生物工程有限公司。

1.2仪器与试剂

高效液相色谱仪(LC-20AD)，日本岛津公司；电热恒温水浴锅(DK-S26型)，上海精宏实验设备有限公司；手提式高速粉碎机；循环式多用真空泵(SHB-ⅢA型)，河南省太康科教器材厂；紫外分光光度计(UV-3600型)。

乙腈(色谱纯)，儿茶素、咖啡碱标准品(购自SIGMA公司)；乙酸、福林酚试剂、水合茚三酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、柠檬酸钠、无水碳酸钠等均为分析纯。

1.3测定指标及方法

1.3.1儿茶素及咖啡碱的HPLC分析条件

用0.45μm微孔滤膜(水膜)过滤，利用高效液相色谱仪对滤液进行分析。色谱柱：日本cosmosil 5C18-AR-Ⅱ柱(4.6 mm×250 mm)。流动相：A相为体积分数为2%的乙酸，B相为体积分数为100%的乙腈。洗脱梯度：0～16 min，B相体积分数由6.5%线性升至15%；16～20 min，B相体积分数由15%线性升至25%；20～25 min，B相体积分数由25%线性降至6.5%。流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为280 nm。

1.3.2茶多酚、游离氨基酸的测定

茶多酚：福林酚法GB/T 8313—2008。

氨基酸：水合茚三酮比色法GB/T 8314—2002。

1.3.3提取率的计算[公式(1)]

T/%=(m/M)×100

(1)

式中：T，某种成分的提取率，%；m，某种成分的含量，g/g干物质；M，提取的某种成分含量，g/g干物质。

1.4数据分析

2结果与分析

2.1茶叶中主要成分含量

2.2浸提方式对有效成分提取效果的影响

在茶水比为1∶20的条件下，将茶叶以不同方式进行提取，提取方式、提取条件及结果见表1。

表1　提取方式及条件对茶叶有效物质浸出的影响

注：CK—纯水浸提；超+纤—超声波协同纤维素酶浸提；超+果—超声波协同果胶酶浸提；超+复合—超声波协同复合酶浸提； 0.1+0.1—0.1%的纤维素酶与0.1%的果胶酶组成的复合酶；数据为3次重复的平均值；同一列数据中标注相同字母的差异不显著；差异显著性水平为P≤0.01。依据相关参考文献及预实验结果，将提取温度设置为50 ℃。

表1表明，超声波协同复合酶浸提下，茶叶主要生化成分的浸出量显著高于其他提取方式，这是由于纤维素酶和果胶酶的作用，使细胞壁的结构被破坏，加之超声波的机械破碎和空化作用，使物质能充分溶出。复合酶辅助浸提与常规浸提的效果相当，二者之间无显著差异。超声波协同单酶的提取效果优于单酶辅助提取，说明超声波辅助对于酶法提取茶叶品质成分具有积极作用。纤维素酶的提取效果较果胶酶要好，这是因为纤维素酶对细胞壁的破坏较果胶酶更为彻底。单一酶法浸提及超声波浸提比纯水浸提效率高，纯水浸提时，细胞壁存在使扩散阻力大，因此细胞内有效成分的提取率相对较低。

常规浸提虽然可以获得较高的提取率，但同时会引起茶叶香气大量挥发、茶汤颜色变化及混浊[12]。超声波协同复合酶浸提，其浸提温度虽比常规浸提低，但超声波强烈的振动作用，使附着在茶叶上的杂物转移到茶汤中[13]，加之酶对细胞壁的水解作用，使茶叶中许多易于茶多酚络合的物质也大量溶出(表2)，这对于茶汤的贮存是不利的。目前，超声波提取多用于实验研究，离工业化生产还有一定距离。复合酶辅助浸提的物质提取率与常规浸提相当，且可在低温下进行，与超声波协同复合酶提取相比，副产物少，操作简便。因此，选择复合酶辅助浸提作为茶叶有效成分的提取方式。

2.3复合酶辅助浸提的单因素实验

2.3.1复配比对提取的影响

红色文化有着不同的形态，主要包含红色根据地、革命遗址以及抗战英雄故居等，也体现在革命精神及其道德文化传统等方面。山西省红色文化种类更加丰富，重要党历史事件以及相关的机构遗址有上千处，革命纪念馆共有738处，抗战英雄的故居共有213处。其中被纳入到国家文物保护单位的有刘胡兰纪念馆、白求恩纪念馆、晋绥边区革命纪念馆、晋西北行政公署遗址、晋绥解放区革命烈士陵园等。

在茶水比为1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取温度50 ℃、提取时间60 min，复合酶添加量为0.2%(复合酶质量与样品质量的百分比，下同)，复配比[m(纤维素酶)∶m(果胶酶)]为1∶3、2∶3、1∶1、3∶1、3∶2的条件下，分别测定茶多酚、氨基酸、咖啡碱及水浸出物的提取率。复配比与有效成分的提取率关系如图1。

m(纤维素酶)∶m(果胶酶)1-咖啡碱；2-水浸出物；3-氨基酸；4-茶多酚图1　复配比对茶叶有效成分提取率的影响Fig.1　Effects of the composite ratio on extraction rate of tea leaves effective components

从图1可以看出，随着复配比的增加，茶多酚、咖啡碱及水浸出物的提取率先增加，复配比为1∶1时，提取率达到最大值，继续增加复配比，各物质的提取率下降。方差分析表明,氨基酸的提取率变化同上，其提取率达到最大值的复配比为3∶2。综合方差分析结果及上述趋势，后续实验均采用[m(纤维素酶)∶m(果胶酶)]=1∶1的酶解方式进行。

2.3.2酶添加量对提取的影响

在茶水比为1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取温度50 ℃、提取时间60 min，[m(纤维素酶)∶m(果胶酶)]为1∶1，复合酶添加量为0.05%、0.2%、0.35%、0.5%及0.65%的条件下，分别测定茶多酚、氨基酸、咖啡碱及水浸出物的提取率。复合酶添加量与有效成分的提取率关系如图2。

1-水浸出物；2-咖啡碱；3-茶多酚；4-氨基酸图2　酶添加量对茶叶有效成分提取率的影响Fig.2　Effects of the enzyme amount on extraction rate of tea leaves effective components

由图2可知，随着复合酶总量的增加，各物质的提取率增大，在酶添加量为0.2%时，茶多酚的提取率达到最大，之后趋于平衡。当添加量增加到0.35%时，其他3种成分的提取率达到最大。这是因为随着复合酶用量的增加，底物与酶充分结合，促进物质不断浸出。当酶添加量超过0.35%时，复合酶相对于底物浓度过饱和，物质的提取率不再提高。对提取率进行方差分析，发现各物质的提取率在同一处理水平下存在显著差异，说明相同条件下，物质的浸出能力不同。从复合酶的利用率及物质的提取率考虑角度，选择0.35%作为复合酶的添加量。

2.3.3温度对提取的影响

在茶水比为1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取时间60 min，纤维素酶∶果胶酶为1∶1，复合酶添加量为0.35%，温度为30、40、50、60、70 ℃的条件下，分别测定茶多酚、氨基酸、咖啡碱及水浸出物的提取率。提取温度与有效成分的提取率关系如图3所示。

图3　温度对茶叶有效成分提取率的影响Fig.3　Effects of the extraction temperature on extraction rate of tea leaves effective components

由图3可知，各物质的提取率随着提取温度的升高不断增加， 50 ℃时达到最大值，继续升高温度提取率开始下降，水浸出物提取率的下降程度显著高于其他物质，说明温度对水浸出物提取的影响较大。这是因为在一定温度范围内，随着温度的升高，酶活性加强，有利于复合酶对细胞的水解破坏，物质不断浸出，此外，升高温度还能提供酶解反应所需的活化能[14]；温度过高时，导致酶变性，催化活性减弱，有效成分的溶出量相对降低。

2.3.4时间对提取的影响

在茶水比为1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取温度50 ℃，纤维素酶∶果胶酶为1∶1，复合酶添加量为0.35%，时间为30、45、60、75、90 min的条件下，分别测定茶多酚、氨基酸、咖啡碱及水浸出物的提取率。提取时间与有效成分的提取率关系如图4所示。

图4　提取时间对茶叶有效成分提取率的影响Fig.4　Effects of the extraction time on extraction rate of tea leaves effective components

由图4可知，在浸提前期(30～60 min)茶多酚、咖啡碱及水浸出物的提取率快速增加，浸提中后期(60～90 min)，茶多酚及水浸出物的提取率增加缓慢，并趋于平衡，氨基酸提取率略有下降，可能在反应初期，底物浓度和酶的活性均较高，酶解反应较充分，随着反应进行，产物积累到一定程度时，抑制了酶的活力，物质较少或不再溶出。

2.3.5pH对提取的影响

在茶水比为1∶20(g∶mL)，提取温度50 ℃，提取时间75 min，m(纤维素酶)∶m(果胶酶)为1∶1，复合酶添加量0.35%，pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的条件下，分别测定茶多酚、氨基酸、咖啡碱及水浸出物的提取率。pH与有效成分的提取率关系如图5所示。

图5　pH对茶叶有效成分提取率的影响Fig.5　Effects of pH on extraction rate of tea leaves effective components

由图5可知，随着pH的升高，茶多酚、咖啡碱及水浸出物的提取率逐渐下降。可能是pH的升高使酶的构象发生改变，活性降低，与底物的结合能力较弱，因而不能促进有效成分进一步溶出。氨基酸的提取率受pH的影响较大，呈现先快速增加后趋于稳定的趋势，这可能与茶汤过低的pH值影响了氨基酸测定过程中缓冲液的pH，从而使吸光度发生变化。此外，方差分析表明，当pH超过5.5时，各物质之间的提取率无显著差异。

2.4复合酶辅助浸提正交实验与优化

基于单因素试验结果，在一定试验条件下，茶多酚与咖啡碱提取率的变化趋势基本一致，而氨基酸和水浸出物的提取率受某些条件的影响较大，因此，选取茶多酚、氨基酸及水浸出物的提取率作为工艺优化的响应值。工艺优化试验选取酶解温度(A)、酶解时间(B)、酶解pH(C)、复合酶添加量(D)4个因素，进行L9(34)正交实验。试验因素水平见表2；试验设计及结果见表3。

表2　正交试验因素水平表

表3　正交试验设计及结果

由表3可知，影响茶多酚提取率的因子主次顺序为C>A>D>B，提取的最佳组合为A3B3C2D2；影响氨基酸提取率的因子主次顺序为C>B>A>D，提取的最佳组合为A2B2C3D2；影响水浸出物提取率的因子主次顺序为C>A>D>B，提取最佳组合为A1B3C1D3。由于3个指标单独分析确定的最优条件并不一致，因此需结合方差分析进行综合考虑。

对茶多酚、氨基酸及水浸出物的提取率进行方差分析，结果见表4、表5和表6。

表4　茶多酚提取率的方差分析

表5　氨基酸提取率的方差分析

表6　水浸出物提取率的方差分析

方差分析结果表明，酶解pH对茶多酚及氨基酸的提取率有极显著影响，对水浸出物的提取率有显著影响； 酶解温度对茶多酚的提取率有极显著影响；酶解温度及酶解时间对氨基酸的提取率有显著影响。复合酶的添加量对各成分的提取率影响都不显著。

对因素A而言，其对茶多酚的影响是极显著的，选择A3为好；而对氨基酸的影响是显著的，选择A2为好；对水浸出物无显著影响。取A3时，茶多酚的提取率相对提高1.7%，水浸出物的提取率相对提高0.9%，取A2时，氨基酸的提取率相对提高1.9%，从生产成本角度，选择A2(50 ℃)较好。同理对因素B、C、D进行分析，综合平衡后确定出最优提取条件为A2B2C1D2。

2.5验证实验

对确定的最优条件，即酶解温度为50 ℃、酶解时间75 min、酶解pH5.0、复合酶添加量为0.2%进行验证实验，结果见表7。该提取条件下，物质的综合提取率相对较高。

表7　优化条件下有效成分的提取率

3结论

比较9种提取方式对茶叶有效成分提取率的影响，发现以纤维素酶与果胶酶按照1∶1的复配比组成的复合酶，对茶多酚、氨基酸及咖啡碱的提取率与常规浸提法相当。与其他方式相比，复合酶辅助提取法具有反应条件温和、操作简便等特点，具有较为广阔的应用前景。实验选择复合酶辅助法对茶叶进行提取。

通过实验，得到的最优提取条件为：酶解温度50 ℃、酶解时间75 min、酶解pH5.0、复合酶添加量0.2%。在此条件下有效成分的提取率分别为：茶多酚77.79%、氨基酸70.62%、水浸出物83.05%、咖啡碱82.13%。

武永福[14]的实验表明，纤维素酶和果胶酶的添加量各为0.25 %，原料粉碎至16目，温度50 ℃，提取时间60 min，茶水比1∶15提取两次(1∶8和1∶7)，在此条件下茶多酚的提取率较常规提取稍低，水浸出物为常规浸提的1.24倍。在本试验优化条件下，茶多酚的提取率较常规提取高出10.72%，水浸出物的含量较常规提取高4.22%。谭淑宜[15]比较了不同酶组合对绿茶化学成分的提取效果发现，0.3%纤维素酶与0.1%果胶酶组合对水浸出物的提取效果较好，与对照相比高出21.8%，氨基酸的提取率比对照高出27%，但茶多酚和咖啡碱的提取效果不明显。在本试验最优条件下，各物质的提取率与对照相比都有明显增加，其中茶多酚提取率比对照高出26.72%、咖啡碱高出23.90%、水浸出物高出11.51%，氨基酸增加1.03%。由于茶叶品种和处理方式不同，提取工艺条件也有区别，因此文献中茶叶各种化学物质的提取率存在一定差异，但在本试验的优化条件下，各物质均有较好的提取率，这对于实际生产具有一定的参考价值。

参考文献

[1]肖文军,龚志华.超声波技术在绿茶浸提中的应用研究[J].天然产物研究与开发,2006,18(1):130-133.

[2]周鹏,谢明勇,傅博强，等.茶叶粗多糖的提取及纯化研究[J].食品科学,2001,22(11):46-47.

[3]严明潮,徐向群,单夏锋.提取条件对茶多酚制品儿茶素组成的影响[J].茶叶科学,1996,16(2):155-156.

[4]张文文,扬春,林朝锡.冷浸对液态茶饮料品质影响的试验研究[J].食品科学,1998,19(8):24-26.

[5]代忠波.茶饮料萃取技术研究现状[J].饮料工业,2013,16(9):39-45.

[6]XIA Tao, SHI Si-quan, WAN Xiao-chun.Impact of ultrasonic-assisted extraction on the chemical and sensory quality of tea infusion [J].Journal of Food Engineering,2006,74(4):557-560.

[7]KAMALJIT V, RAYMOND M, LOYD S, et al.Application and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry-A review [J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2008,9(2):161-169.

[8]孙庆磊.超声波浸提对绿茶饮料茶汤品质的影响[D].杭州:浙江大学,2005.

[9]龚玉雷,魏春,王芝彪，等.生物酶在茶叶提取加工技术中的应用研究[J].茶叶科学,2013,33(4):311-321.

[10]张卫红,张效林.复合酶法提取茶多酚工艺条件研究[J].食品研究与开发,2006,27(11):5-7.

[11]蒋丽,王雪梅,全学军，等.不同提取方法对茶多酚理化性质的影响[J].食品科学,2010,31(14):136-139.

[12]夏涛,时思全,宛晓春.微波、超声波对茶叶主要化学成分浸提效果的研究[J].农业工程学报,2004,20(6):170-173.

[13]宁井铭,周天山,方世辉，等.绿茶饮料不同浸提方式研究[J].安徽农业大学学报,2004,31(3):288-291.

[14]武永福.酶在速溶绿茶浸提中的应用研究[D].重庆:西南大学,2011.

[15]谭淑宜,曾晓雄,罗泽民.提高速溶茶品质的研究[J].湖南农学院学报,1991(4):708-712.

Optimization of enzyme-assisted extraction on effective components from tea leaves

YANG Liu-yan1,2, JIANG He-yuan1*,ZHANG Jian-yong1, XU Bin1,2,LIU Qian-lu1,2, WANG Wei-wei1

1(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tea Plants Biology and Resources Utilization of Agriculture Ministry,Key Laboratory of Tea Processing Engineering of Zhejiang, Hangzhou 310008, China)2(Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

ABSTRACTWith tea leaves crushed into particle size of 0.63 mm as the raw material, the effects of different extraction methods on the extraction of effective components were studied, and the conditions of composite enzyme-assisted extraction were optimized. The results showed that composite enzyme (cellulase and pectinase) was preferably used to extract the effective components, furthermore, the extraction condition of this method was mild and the manipulation was simple. The extraction rate of tea polyphenols, amino acid and water extracts were used as the response values. On the basis of single-factor test, the optimized extraction conditions using a orthogonal design of four factors at three levels were extraction temperature 50 ℃, extraction time 75 min, pH 5.0, and 0.2% composite enzyme. Under these conditions, the extraction rates of effective components were 77.9% of polyphenols, 70.62% of amino acids, 83.05% of water extracts, and 82.13% of caffeine, respectively.

Key wordstea leaves; enzyme-assisted; effective components; optimization

收稿日期：2015-07-14，改回日期：2015-10-13

基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201503142-11)；中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2015-TRICAAS)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602038

第一作者：硕士研究生(江和源研究员为通讯作者，E-mail:jianghy@tricaas.com)。