规律成簇的短回文重复序列/Cas9的研究进展*

虞　飞， 王亚楠， 张学明

(包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014040)



规律成簇的短回文重复序列/Cas9的研究进展*

虞飞， 王亚楠， 张学明

(包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014040)

[摘要]规律成簇的短回文重复序列(clustered regularly intespaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas系统是最近兴起的一项基因编辑技术，在基因编辑中有着不可或缺的作用。CRISPR是继锌指人工核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)和类转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nuclease,TALEN)之后的第三代人工合成的核酸酶，有着ZFN、TALEN不具备的众多优点，所以CRISPR正在慢慢取代ZFN和TALEN，成为最主要的人工核酸酶并广泛应用在基因编辑中。而CRISPR/Cas9是CRISPR/Cas系统中最为简单的，也是现在基因编辑技术中应用最为广泛的一种。下面从CRISPR/Cas9的工作原理、构建和研究进展等几个方面对其做一个简要综述，为在这一个领域的研究工作者提供一个参考。

[关键词]规律成簇的短回文重复序列/Cas9；人工核酸酶；基因编辑

基因打靶技术是上世纪80年代新兴的一种通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的一项新型分子生物学技术。但是传统的基因打靶效率低，一般在1×10-6以下，特别是对于没有干细胞建系的大型的哺乳动物效率更低。因此，自然条件下的基因打靶很难成功的实现。随着分子生物学技术的发展，锌指人工核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)的应用，使得基因打靶效率较传统的基因打靶成功率得到提高。ZFN能识别特异的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)序列，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后由细胞固有的DNA修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复，使基因打靶效率提高了3～5个数量级，而且具有极高的特异性，从而达到DNA靶向修饰的目的。此后，相继出现了比ZFN更有前景的类转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nuclease,TALEN)和规律成簇的短回文重复序列(clustered regularly intespaced short palindromic repeats,CRISPR)。但是，在三种人工核酸酶中，ZFN具有脱靶切割导致的细胞毒性及上下文依赖效应和设计繁琐等缺点；TALEN的分子量较大，构建复杂、成本高，而且易增加操作过程中的难度等不利因素；而由RNA来引导的CRISPR/Cas9具有ZFN和TALEN所不具有的优点，如可以同时一次性敲除多个数量的单个基因、具有优良的靶向性、打靶成功率高于TALEN和ZFN，而且构建简单、成本低等。故CRISPR/Cas9技术自2013年首次应用以来[1]，就迅速的被广大中外研究人员接受而广泛应用于研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。

1CRISPR/Cas9介导基因打靶的工作原理

CRISPR/Cas9结构包括三大部分：5′端的反式激活核糖核酸(trans-activating ribonucleic acid，tracrRNA)基因；中间部分的Cas蛋白结构基因和3′端的CRISPR基因座。由这三部分表达出的tracrRNA和crRNA组成RNA二聚体，然后与Cas9蛋白结合后识别切割靶位点。切割后细胞启动自身的修复机制，一类是非同源末端连接修复，能够导致基因敲除；另一类是当提供供体DNA作为供模板时，细胞就会启动HR修复机制，实现基因片段的插入，当需要做一个点突变和小片段的缺失或插入时，需要一条可达200 bp的单链寡聚脱氧核糖核苷酸链模板，当需要做一段较大片段的基因的插入时，供体DNA就必须是一个含有待插入的目的基因和两端同源臂的双链DNA质粒[2]。见图1。

2CRISPR/Cas9的构建

CRISPR/Cas9是由一条RNA来引导Cas9去切割靶DNA，所以，CRISPR/Cas9设计就只需设计一条引导RNA去识别并结合靶DNA，然后引导Cas9蛋白去切割DNA即可。

2.1引导RNA设计在CRISPR/Cas9的构建中，引导RNA设计是关键，决定CRISPR/Cas9的活性和基因编辑的成败。引导RNA由tracrRNA和crRNA组成的RNA二聚体，二聚体的5′端为与靶DNA互补序列互补，3′端序列与Cas结合；早期设计中，将tracrRNA和crRNA单独表达，设计成两条独立的RNA链，但在实验过程中发现，容易产生错配和脱靶效应；随后，为了减少脱靶效应，将tracrRNA和crRNA融合成一条链即单导向核糖核苷酸(single guide RNA，sgRNA)[3]。这种由一条RNA来引导的Cas9切割靶DNA，可降低脱靶效应的概率，而且还加快靶DNA的切割速度。

2.2靶序列的选择在靶序列选择时，首先要选择下游含有PAM的序列。通过定性和定量的方法系统地研究了PAM对CRISPR/Cas9基因编辑的影响，得出结论是NGG、NGA、NAG这三种PAM结构都能与Cas9有效地结合，并且介导切割效率依次是NGG>NGA>NAG。

2.3Cas9的靶向运输在设计好引导RNA后，就可以将引导RNA(目前一般为sgRNA)和Cas9蛋白导入生物组织或者培养的细胞中。通常可通过电穿孔、慢性病毒载体转染、脂质体介导等方法转染细胞；对真核细胞基因组DNA编辑时，Cas9的N或者C端新增加一段核定位信号NLS，指导Cas9进入细胞核，能够提高基因组编辑效率。

3CRISPR/Cas9的研究进展

CRISPR结构从发现到功能的确定共经历了20多年的时间，科学家在研究细菌进化过程中，发现细菌在长期的进化过程中，往往通过各种各样的策略来使自己适应各种环境，而在基因水平上，细菌能获得新的外源基因促使它抵抗环境，而获得新的外源基因促使它抵抗环境的一种方式就是通过用CRISPR/Cas9系统来完成。

与ZFN和TALEN不同的是CRISPR/Cas9系统是由一个小的、简单的RNA片段去识别靶序列，更为简单，效果更好。到目前为止，CRISPR/Cas9已经在许多生物细胞上得到成功应用，

在模式生物中的应用已有很多相关报道[4]。然而，在没有干细胞建系的非灵长类大型哺乳动物中，CRISPR/Cas9的应用的相关报道比较少。在2013年，人工核酸酶CRISPR/Cas9首次应用在哺乳动物细胞基因组编辑中[5]，为这一技术广泛的应用奠定了基础。2014年利用CRISPR/Cas9介导山羊原代成纤维细胞基因打靶时，在对单等位基因和双等位基因打靶时，有着很好的效果；在单等位基因打靶后通过体细胞核移植，成功获得突变体小山羊；但是，他们在对四个等位基因同时进行基因打靶时，效果不好，容易产生脱靶效应。Hai等[6]设计出了针对猪vWF基因座上第5外显子的CRISPR/Cas9，并成功介导基因打靶，得到突变体小猪。Whitworth等[7]利用CRISPR/Cas9对猪基因组进行两组打靶实验，一组是在体细胞内，对CD163、CD1D这两基因进行打靶，随后将突变细胞核进行核移植，有很好的打靶效率并得到突变小猪；另一组是在体外受精的受精卵细胞进行针对eGFP、CD163和CD1D基因的基因打靶，发现此方法的打靶具有少量的胚胎毒性，但也能得到突变体小猪。Heo等[8]利用CRISPR/Cas9系统实现了对牛的诱导多功能干细胞中NANOG基因座的基因的编辑，并取得了很好的打靶结果。除了在诱导多功能干细胞中进行打靶外，Choi等[9]在利用CRISPR/Cas9系统对表达绿荧光蛋白的原代牛胎儿成纤维细胞的eGFP基因进行突变，取得了40%多的阳性结果，以突变细胞为核供体进行体细胞核移植，重构胚能够发育到囊胚期。最近利用CRISPR/Cas9介导人FGF2基因在牛胎儿成纤维细胞基因组中的定位整合，结果得到阳性克隆细胞，并利用这些阳性克隆成功进行了核移植，得到囊胚。

非灵长类动物作为神经退行性疾病等模型在人类医药研究中具有很大的优势和意义[10]，2013年，Mali等[5]通过构建Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，然后利用非同源重组末端连接修复的方式，在多种人类细胞系中获得了预期的基因突变，结果得出，突变效率与细胞类型和RNA表达载体有关，突变效率在2 %～38 %之间。此后，Niu等[11]成功地实现了利用CRISPR/Cas9在非人类的灵长目动物-猴子受精卵中介导的基因打靶，将编码Cas9的mRNA和sgRNA注射入受精卵中，最终筛选出阳性克隆，从而实现基因打靶。

总之，CRISPR/Cas技术的出现，大大提高了科学家对基因组序列进行修饰和编辑的能力，这将推动对基因工程的研究。

4CRISPR/Cas的前景及展望

目前，虽然对CRISPR/Cas系统的功能和作用机理以及参与的蛋白质等诸多方面的研究取得了极大的进展，但是，CRISPR/Cas系统仍然处于发展之中，势必存在一些不足，在应用中，我们也要注意到，CRISPR/Cas系统免疫功能和作用机理的了解仍然很有限，许多过程中的一些细节依然不太清楚。而且，对于CRISPR/Cas系统，还有一些缺点，如：对于可能的脱靶效应我们该怎样去克服和优化，虽然在很多研究中，采取各种措施去优化，比如，降低sgRNA与Cas9的浓度，但是有研究称，这样会同时降低打靶效率[12]。这些均需要更多的实验来进行深层次的研究。

参考文献

[1]Cong L,Ran FA,Cox D,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-823.

[2]Mou H,Kennedy Z,Anderson DG,et al.Precision cancer mouse models through genome editing with CRISPR-Cas9[J].Genome Med，2015，7(1):53.

[3]Yin H,Xue W,Chen S,et al.Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype[J].Nat Biotechnol，2014，32(6):551-553.

[4]Moreno-Mateos MA,Vejnar CE,Beaudoin JD,et al.CRI-SPR scan:designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo[J].Nat Methods，2015，12(10):982-988.

[5]Mali P,Yang L,Esvelt KM,et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science,2013,339(6121):823-826.

[6]Hai T,Teng F,Guo R,et al.One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system[J].Cell Res，2014，24(3):372-375.

[7]Whitworth KM,Lee K,Benne JA,et al.Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos[J].Biol Reprod，2014，91(3):78.

[8]Heo YT,Quan X,Xu YN,et al.CRISPR/Cas9 nuclease-mediated gene knock-in in bovine-induced pluripotent cells[J].Stem Cells Dev，2015，24(3):393-402.

[9]Choi W,Yum S,Lee S,et al.Disruption of exogenous eGFP gene using RNA-guided endonuclease in bovine transgenic somatic cells[J].Zygote，2015，23(6):916-923.

[10]杨伟莉,涂著池,李晓江.CRISPR/Cas9系统:构建非人灵长类动物疾病模型的新技术[J].中国比较医学杂志,2014,24(8):70-74.

[11]Niu Y,Shen B,Cui Y,et al.Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.Cell,2014,156(4): 836-843.

[12]Fu Y,Foden JA,Khayter C,et al.High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nat Biotechnol，2013，31(9):822-826.

The development of clustered regularly intespaced short palindromic repeats

YU Fei, WANG Yanan, ZHANG Xueming

(BiochemistryDepartmentofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China)

ABSTRACTClustered regularly intespaced short palindromic repeats (CRISPR) /Cas system is a newly developed gene editing technology, which plays an indispensable role in genetic editing. CRISPR is the third generation of artificial nuclease after zinc finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effectors nuclease (TALEN), with more advantages than ZFN and TALEN. Therefore, CRISPR is gradually replacing ZFN and TALEN, becoming the main artificial nuclease and is widely used in genetic modification. CRISPR/Cas9 is the simplest in the CRISPR/Cas system and is widely used in genetic modification. This review describes the mechanism, the design and the application of CRISPR/Cas9 system, providing reference for the researches in the field.

KEY WORDSClustered regularly intespaced short palindromic repeats /Cas9; Artificial nuclease; Genetic editing

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(31060304)；包头医学院博士启动基金(BSJJ201602)

通讯作者：张学明

(收稿日期：2015-10-15)