十全大补汤对小鼠原发性肝癌的生长及血管生成的影响

2016-06-13 11:25李书征
当代医学 2016年25期
关键词:抑素生长因子内皮

李书征

十全大补汤对小鼠原发性肝癌的生长及血管生成的影响

李书征

目的 研究十全大补汤对小鼠原发性肝癌生长以及其血管生成的影响。方法 通过小鼠肝癌细胞CT-26接种小鼠,构建荷兰裸鼠原发性肝肿瘤模型,随机分为对照组和研究组,其中对照组给予生理盐水治疗,研究组给予十全大补汤治疗。治疗10 d后取小鼠血液分析其中小鼠血清中血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素水平,并测量2组小鼠的肿瘤大小和质量,免疫组织化检测转移瘤微血管密度及细胞增殖。结果 与对照组相比,研究组小鼠血清中血管内皮生长因子表达降低(P<0.05),血管抑素和内皮抑素表达上调(P<0.05),肿瘤组织Ki 67明显降低(P<0.05),转移瘤微血管密度明显降低(P<0.05),并且研究组小鼠的肿瘤质量和尺寸均小于对照组(P<0.05)。结论 十全大补汤能够抑制小鼠原发性肝癌肿瘤的生长,扰乱小鼠血清内血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素的表达水平,抑制肿瘤血管的生成,对原发性肝癌小鼠的治疗具有一定的临床价值。

十全大补汤;肝癌;血管;生长

十全大补汤主要有四君子汤和四物汤,加上黄芪和肉桂组成的一剂具有补气补血等功效的中药。临床研究表明[1],对于食物不足、贫血患者具有很好的疗效。此外,也有学者在研究肿瘤治疗时发现,十全大补汤对于肿瘤的生长和血管的生成具有抑制作用[2]。本文建立原发性小鼠肿瘤模型,研究十全大补汤对小鼠原发性肝癌生长以及其血管生成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 4~6周龄小鼠,国家啮齿类实验动物种子中心,SPF级,许可证号:SCXK(京)2009-0017;CT-26小鼠肝癌细胞株,购买于中科院上海细胞库;十全大补汤药物:人参6 g、肉桂3 g、黄芪12 g、白术9 g、熟地黄12 g、白芍9 g、当归9 g以及炙甘草3 g,购买于本地某医院;1640培养基,购买于Gibco公司;青霉素和链霉素,购买于Solarbio公司;胎牛血清,购买于Gibco;小鼠血管内皮生长因子、内皮抑素和血管抑素检测试剂盒,购买于OXOID公司,TUNEL和MVD检测试剂盒,购买于GiBcoBRL公司;Ki 67单克隆抗体、羊抗鼠酶标抗体和TMB显色液,购买于天津三箭生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将小鼠肝癌细胞CT-26从液氮中去除37℃快速融化复苏细胞,将细胞加入到15 mL的离心管中,加入5 mL 1640培养基,1 000 rpm/min,离心10 min,将培养基弃去,加入5 mL含有10%胎牛血清的1640培养基将细胞重悬,至于二氧化碳培养箱内进行培养待用(5%二氧化碳,37℃)。

1.2.2 小鼠肝癌肿瘤模型建立 复苏并培养小鼠原发性肝癌细胞CT-26,将其培养到对数期,使用PBS工作液将其制备成单细胞悬浮液,采用台盼蓝染色液对其进行活细胞计数,调整细胞浓度为2.5×106个/mL,取0.2 mL,注射到小鼠左腋下,让其自然生长,待肿瘤体积达到约为500 mm3时即建立成功小鼠肝癌肿瘤模型,随机分为2组,每组10只小鼠,雌雄各半。

1.2.3 治疗方法 对照组小鼠治疗。配置生理盐水,采用0.22微米的过滤器过滤配置好的生理盐水,每天将0.4 mL的生理盐水通过灌胃的方式给予对照组小鼠,共计10 d。

研究组小鼠通过十全大补汤进行治疗。将十全大补汤方剂中的所有药物进行水洗,注意肉桂放在最后,其他药材用清水浸泡30 min,然后用水煎煮1.5 h,共煎煮2次,将2次煎煮的药液过滤后合并在一起,然后继续煎煮浓缩成2 mL的药物混合液,采用0.22微米的过滤器过滤,通过蒸馏水进行稀释,配置成10 mg/mL的治疗用药,放置在4摄氏度的冰箱中保存,用时取出,每天将0.4 mL的治疗用药通过灌胃的方式给予研究组小鼠,共计10 d。

1.2.4 检测方法 肿瘤体积检测:在给药的第2、4、6、8和第10天,测量2组小鼠内的肿瘤体积,具体测量方法为卡钳法测定。

血清中血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素水平的检测:首先,在小鼠给药的第11天,左手拇指、食指和中指抓取小鼠的颈部头皮,小指和无名指固定尾巴,轻压需要摘取的眼部皮肤,使眼球充血突出,使用手术剪剪去小鼠的胡须,防止血从胡须处留下引起溶血,用镊子夹取眼球并快速摘取,并使血液从眼眶内流入EP管中。将取得的小鼠血液,通过离心机离心取上层血清,按试剂盒要求进行血清中血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素水平的检测。

微血管密度及细胞增殖:通过酶联免疫法,利用Ki 67单克隆抗体进行检测,Ki 67单克隆抗体按1∶500进行稀释成工作浓度,二抗采用羊抗鼠酶标抗体1∶500进行稀释。Weidner法检测微血管密度。

1.3 统计学方法 记录2组患者治疗前后各指标变化情况,通过软件SPSS 17.0进行统计学分析,计量资料采用“x±s”表示,组间比较采用t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组小鼠肿瘤生长的对比 2组小鼠在接种CT-26细胞第6天到第10天内全部成瘤,组内肿瘤体积比较差异无统计学意义。在接种细胞的第11天将小鼠处死,取出肿瘤,测定其体积,发现采用十全大补汤进行治疗的小鼠肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组小鼠肿瘤生长对比

2.2 2组小鼠血管生成比较 2组小鼠通过10 d的治疗后,研究组血清中的生长因子内皮生长因子表达水平要比对照组低(P<0.05),抑制因子血管抑素和内皮抑素要比对照组高(P<0.05),说明通过十全大补汤的治疗能够抑制原发肝癌小鼠肿瘤血管的生成。同时,转移瘤微血管密度及细胞增殖检测结果为研究组细胞核Ki 67的表达水平要比对照组低(P<0.05)。见表2。

表2 2组小鼠血管生成对比(x±s)

3 讨论

“十全大补汤”选鲜料加入十味中药,五味小料,五味调料,细火炖制而成,既是一道咸鲜味浓的汤菜,又是一款药膳,富有营养,滋补身体,久食对冠心病、高血压、糖尿病、贫血、气喘、面黄体弱者有一定的疗效[3-4]。血管生成抑制因子可以以多种因子为靶标抑制血管的形成。这些因子包括:MMP、各种生长因子或者生长因子受体、内皮细胞等[5]。而血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor),可在体内诱导血管新生[6]。

国内外研究表明,在小鼠体内,有很多因素影响小鼠肿瘤血管的生成[7],其中促进血管生长的生长因子和抑制因子的调解作用影响最为重大[8],本文研究测定小鼠血清中的血管内生长因子和抑制因子血管抑素以及内皮抑素的含量,发现研究组小鼠的促血管生成因子表达降低,抑制因子表达下降,这与前人的额研究结果相一致[9],说明十全大补汤能够有效抑制原发性肝癌肿瘤血管的生成。Ki-67是一种核蛋白,与核糖体RNA转录有关,其失活将会导致核糖体RNA合成受限[10]。此外,Ki-67在细胞增殖的各期(G 1,S,G 2和M)中均有表达,但在细胞静止期G 0期不表达。相关研究表明,Ki 67在诊断肿瘤细胞增殖活性的研究中具有十分重要的意义[11]。本文通过测定Ki 67评价十全大补汤的药物治疗疗效,结果表明十全大补汤可以抑制肿瘤细胞的增殖。

综述所述,十全大补汤能够抑制小鼠原发性肝癌肿瘤的生长,扰乱小鼠血清内血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素的表达水平,抑制肿瘤血管的生成,对原发性肝癌小鼠的治疗具有一定的临床价值。

[1] Matsuo M,Tani T,Saiki I.Organ selecticity of Juzen-taiho-to and Ninjin-yoei-to in the experssion of anti-matastatic efficacy[J].J Trad Med,2002,19(3):93-97.

[2] Moserle L,Amddori A,Indraccol S.The angeiogenuic switchnimplications in the regulation of tumor dormancy[J].Curr Mol Med,2009,9(8):935-941. [3] 苏鹏飞,李伟,段东奎,等.十全大补汤联合肠内营养支持在肺癌手术患者中的应用效果[J].南京中医药大学学报,2015,31(1):17-20.

[4] 杜春海,戎瑞雪,王梦,等.十全大补汤多糖成分抑瘤及免疫调节作用的初步研究[J].河北中医药学报,2014,29(4):3-6.

[5] 史刚刚,甘建琛.血管生成负反馈调节因子Vasohibin家族研究进展[J].天津医药,2014,17(9):949-952.

[6] 王彦敏.血管生成因子VEGF研究进展[J].河北医药,2010,32(11): 1456-1458.

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[9] Leppanen VM,Prota AE,Jeltsch M,et al.Structural determinants of growth factor binding and specificity by VEGF receptor 2[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(6):2425-2430.

[10] 刘巧,凌斌.PIWI、Ki-67与肿瘤关系的研究进展[J].医学综述, 2010,16(4):542-544.

[11] 孟祥林,刘明华.诱导肿瘤细胞凋亡的天然药物研究进展[J].四川生理科学杂志,2010,32(4):169.

Objective To study the influences of growth and angiogenesis of mouse primary liver cance with Shiquandabutang. Methods The mouse hepatoma cells CT-26 vaccinated mice, primary liver tumors in nude mice construct Netherlands were randomly divided into control and study groups, including control group

saline treatment group received treatment Shiquandabutang. 10 d after treatment, taking blood analysis in mice in which the mouse serum vascular endothelial growth factor, angiostatin and endostatin levels and measuring two groups of mice and tumor size, quality, immunohistochemical detection of metastatic tumor microvessel density and cell proliferation. Results Compared with the salinetreated control group, the treatment given Shiquandabutang research group of mice, the expression of vascular endothelial growth factor in serumreduced (P<0.05), angiostatin and endostatin upregulated (P<0.05), tumor Ki 67 was significantly lower (P<0.05), metastatic tumor microvessel density was significantly lower (P<0.05), and the tumor mass and size of the study group were less than the control group of mice (P<0.05). Conclusion Shiquandabutang can inhibit tumor growth in mice with primary liver cancer, within disrupt serum levels of vascular endothelial growth factor, angiostatin and endostatin inhibit tumor angiogenesis, primary liver cancer treatment of mice with a certain clinical value.

Shiquandabutang; Liver cancer; Vascular; Growth

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.25.002

河南 453400 河南省新乡市长垣县中医院门诊西药房 (李书征)

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