苯扎溴铵及土霉素诱导大肠埃希菌耐药株AcrAB- TolC外排泵调控基因变异研究

曾杨梅，杨　森，段培强，陈红伟，吴俊伟（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460）



苯扎溴铵及土霉素诱导大肠埃希菌耐药株AcrAB- TolC外排泵调控基因变异研究

曾杨梅，杨森，段培强，陈红伟，吴俊伟
（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460）

摘要：为探讨细菌对消毒剂和抗菌药物耐药性之间的相关性，本试验分别用亚抑菌浓度苯扎溴铵和土霉素分别对大肠埃希菌质控菌ATCC25922进行体外诱导，测定诱导前后最小抑菌浓度（MIC）的变化；并对诱导后菌株外排泵调控基因acrR、marA、soxS、rob进行PCR扩增和测序，检测其突变情况。结果显示，菌株经苯扎溴铵和土霉素诱导后对苯扎溴铵和土霉素均产生了耐药性，且诱导后的菌株有相同基因的同一位点发生突变，marA、soxS所编码的氨基酸也有同一位点发生突变，提示大肠埃希菌对苯扎溴铵及土霉素的交叉耐药与调控基因位点的突变有一定相关性。

关键词：大肠埃希菌；外排泵；调控基因；土霉素；苯扎溴铵

随着抗菌药物的广泛使用，临床上多重耐药细菌不断出现，细菌耐药机制众多，包括主动外排、改变作用靶位、改变膜通透性等。大肠埃希菌是目前发现外排泵最多的一种细菌，其中AcrAB -TolC是大肠埃希菌最主要的、占绝对优势的多药外排系统［1］。同样，由于消毒剂的广泛使用，细菌对消毒剂亦会产生耐药性。已有相关报道表明［2-4］，亚抑菌浓度的消毒剂能诱导细菌产生耐药，且由消毒剂诱导耐药的菌株可对抗菌药物产生耐药。本试验通过用苯扎溴铵和土霉素分别对大肠埃希菌质控株ATCC25922进行体外诱导，检测诱导后菌株对苯扎溴铵和土霉素的多重耐药性，并对诱导后菌株的AcrABTolC外排泵调控基因acrR、marA、soxS、rob进行测序分析，进一步探究细菌对消毒剂与抗菌药物耐药之间的相关性，以期为临床正确使用消毒剂和抗菌药物提供理论指导。

1　材料与方法

1.1药品土霉素，含量为87.4%；批号：130105，购自石家庄华曙制药集团；苯扎溴铵，含量为5%；批号：130201，购自四川金山制药有限公司。

1.2菌株大肠埃希菌质控菌株ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.3培养基营养肉汤培养基，批号：20120517；营养琼脂培养基，批号：20120719，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.4仪器设备LRH-150型生化培养箱；SWCJ-1F超净工作台；YXQ-LS-50SⅡ型高压蒸汽灭菌锅；数显稳压稳流电泳仪。

1.5体外抑菌试验测定土霉素和苯扎溴铵对质控菌株的MIC。将土霉素溶解，配成5 120 μg/ mL溶液，苯扎溴铵配成0.512%溶液，过滤除菌后，备用。每次试验药液均现配现用。采用试管二倍稀释法进行MIC测定。若第1次试验未能测出相应的MIC，则调整药物浓度。

1.6亚抑菌浓度苯扎溴铵/土霉素诱导大肠埃希菌参照张静等［3］的方法用亚抑菌浓度苯扎溴铵/土霉素诱导大肠埃希菌质控菌，获得耐药性稳定的菌株AB和AO。

1.7苯扎溴铵/土霉素诱导后菌株的MIC测定方法同1.5。

1.8对诱导后菌株AB和AO外排泵调控基因acrR、marA、soxS、rob的PCR扩增及基因测序。

根据GenBank中大肠埃希菌相应基因序列设计PCR扩增引物，其相关信息见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以大肠埃希菌DNA为模板，进行PCR反应。将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1　PCR引物序列

2　结果

2.1苯扎溴铵及土霉素对诱导前后的大肠埃希菌MIC测定苯扎溴铵及土霉素对诱导前后大肠埃希菌的MIC如表2所示，AB和AO对苯扎溴铵和土霉素均高度耐药。

表2　苯扎溴铵及土霉素对诱导前后大肠埃希菌的MIC值（μg/mL）

2.2目的基因测序结果将AB和AOacrR、marA、soxS、rob基因测序结果与质控菌相应序列进行比对，得到碱基及氨基酸突变情况见表3。AB和AO的各基因序列与质控菌比均有不同程度的突变，且导致所编码的部分氨基酸序列也发生了突变。

3　分析与讨论

3.1消毒剂和抗菌药物之间存在多重耐药由表2可以看出，经苯扎溴铵/土霉素诱导的菌株可同时对苯扎溴铵和土霉素产生耐药。亚抑菌浓度的抗菌药物可以诱导细菌耐药，而在低浓度消毒剂持续作用下，细菌的自身耐受性会发生变化而产生生理适应性耐药，细菌对抗菌药物和消毒剂的耐药机制有相似之处，许多介导细菌消毒剂耐药的机制同样可介导细菌对抗菌药物产生耐药，如主动外排泵表达亢进、膜通透性改变等。

3.2体外诱导的耐药大肠埃希菌外排泵调控基因突变细菌的主动外排系统在细菌的耐药过程中起着重要的作用。大肠埃希菌是主动外排泵最多的一种细菌，其中AcrAB-TolC是其最主要的、占绝对优势的多药外排泵，对细菌多药耐药起着重要作用。其表达受多种调控因子的调控，现已发现的主要调控因子有AcrR、MarA、SoxS、Rob等。

由表3可知，诱导后耐药菌株的acrR、marA、soxS、rob基因均发生了碱基突变，且突变具有一定的一致性，部分调控基因所编码的氨基酸序列也发生了改变。

AB和AO的同一调控基因在相同位点有碱基突变：acrR 585位（T→C），soxS 275位T缺失，marA 9位（C→A），rob有6个相同位点的基因发生一致突变。AB和AO的marA和soxS所编码的氨基酸序列也有在同一位点发生突变。这些调控基因突变对大肠埃希菌的药物敏感性均会产生影响。Ruzin［5］曾指出，marA和soxS都是转录时的催化剂，其突变可使AcrAB的表达增加，导致菌体内药物外排作用增强。Poole等［6］曾报道AcrAB-TolC外排泵在最低水平表达时主要受AcrR的负向调控，acrR基因的无意义突变使acrAB基因的表达水平可能提高2倍。Miller等［7］也指出在大肠埃希菌中rob的无意义突变可增加其对有机溶剂的敏感性。可推测大肠埃希菌对苯扎溴铵及土霉素的耐药机制具有相似性且与AcrAB-TolC调控基因变异有一定的相关性。

参考文献：

［1］Sulavik M C，Houseweart C，Cramer C，et al.Antibiotic susceptibility profiles of Escherichia coli strains lacking multidrug efflux pump genes［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45（4）：1126-1136.

［2］Michea-Hamzehpour M，Kahr A，Pechere J C . In vitro stepwise selection of resistance to quinolones，beta-lactams and amikacin

表3　各基因的碱基序列及氨基酸序列突变情况

in nosocomial gram-negative bacilli［J］.Infection，1994，22 Suppl 2：S105-S110.

［3］张静，吴开菊，马保瑞，等.消毒剂诱导大肠杆菌质控菌耐药与抗菌药物耐药相关性试验［J］.中国兽医杂志，2011，47 （11）：40-41.

［4］张静，刘晴晴，马保瑞，等.苯扎溴铵和氯已定诱导的大肠埃希菌耐药性分析［J］.畜牧兽医学报.2012，43（4）：615-619.

［5］Ruzin A，Visalli M A，Keeney D，et al.Influence of transcriptional activator RamA on expression of multidrug efflux pump AcrAB and tigecycline susceptibility in Klebsiella pneumoniae［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（3）：1017-1022.

［6］Poole K . Efflux- mediated resistance to fluoro- quinolones in gram-negative bacteria［J］. Antimicrob Agents Chemother，2000，44（9）：2233-2241.

［7］Miller P F，Sulavik M C.Overlaps and parallels in the regulation of intrinsic multiple-antibiotic resistance in Escherichia coli［J］. Mol Microbiol，1996，21（3）：441-448.

Study on the Mutation of AcrAB- TolC Efflux Pump Regulator Genes of Resistant Escherichiacoli Induced inVitroby Benzalkonium bromideor Oxytetracycline

ZENG Yang-mei，YANG Sen，DUAN Pei-qiang，CHEN Hong-wei，WU Jun-wei
（Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Rongchang Campus，Chongqing 402460，China）

Abstract：To explore the correlation of resistance between disinfectants and antimicrobial drugs，Escherichia coli control strain was separately induced in vitro by sub-inhibitory concentration of benzalkonium bromide and oxytetracycline，and the change of MIC before and after induction was determined.The mutations of acrR，marA，soxS and rob that are regulator genes of AcrAB-TolC efflux pump were determined by PCR amplification and sequencing . The results showed that the induced strains produced resistance against both benzalkonium bromide and oxytetracycline.And there were mutations occurred at the same site on the same gene of the two induced strains.The change of amino acid sequence that encoded by marA and soxS was nearly the same.These results suggest that one multi-drug resistant reason of the two induced strains is probably the mutations of the AcrAB-TolC efflux pump regulator genes.

Key words：Escherichia coli；efflux pump；regulator gene；oxytetracycline；benzalkonium bromide Corresponding author：WU Jun-wei

中图分类号：S852.65+2

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0013- 02

收稿日期：2014-11-21

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31372483）

作者简介：曾杨梅（1989-），女，硕士生，研究方向为兽医药理学与药物制剂，E-mail：530265641@qq.com

通讯作者：吴俊伟，E-mail：wjw999@163.com