牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法的建立

张　蕾，肖　进，2，董春娜，巴利民，栗利芳，宋　芳，王　楠，周　强，齐　鹏，汪　明，2（.中牧实业股份有限公司农业部兽用生物制品与化药重点实验室北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心，北京丰台00070；2.中国农业大学动物医学院，北京海淀0093）



牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法的建立

张蕾1，肖进1，2，董春娜1，巴利民1，栗利芳1，宋芳1，王楠1，周强1，齐鹏1，汪明1，2
（1.中牧实业股份有限公司农业部兽用生物制品与化药重点实验室北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心，北京丰台100070；2.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

摘要：根据牛口蹄疫O型3个拓扑型VP1序列设计3条合成肽，以此为包被抗原建立牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法，并对该方法敏感性、特异性和重复性进行验证。结果显示，该方法敏感性为96.7%，特异性为99.1%，批内和批间变异系数分别为2.1%～9.8%和3.5%～10.7%。与2种商品化试剂盒比较，符合率分别为93.5%和85.9%。结果表明，该方法敏感性好、特异性强、稳定性高，可用于牛口蹄疫O型抗体水平检测。

关键词：牛；口蹄疫；合成肽；ELISA

肖进（1978-），男，博士生，工程师，从事合成肽疫苗及诊断试剂研发工作，E-mail：xjpeptide@126.com

注：肖进与张蕾对本文具有同等贡献

（1.China Animal Husbandry Industry Co.Ltd.Ministry of Agriculture Key Laboratory of veterinary biologics and drugs；Veterinary peptide vaccine design and preparation of engineering and technology center of Beijing，Beijing 100070，China；

2.College of Veterinary medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

口蹄疫（FMD）是由FMDV引起偶蹄动物的烈性传染病，该病毒传播途径多、传染性强，严重危害畜牧业发展及畜产品生产供应，世界动物卫生组织（OIE）在1984年将口蹄疫列为A类传染病之首。FMDV有A、O、C、SAT I、SAT II、SAT及Asia 1七个血清型，每个型又分为若干个亚型，型及亚型间无交叉保护［1］。FMDV衣壳含有VP1、VP2、VP3和VP4共4种结构蛋白，其中VP1暴露于病毒颗粒表面，能诱导感染动物产生中和抗体，在分子流行病学调查、血清型分析等方面具有较重要学术价值和现实意义［2］。由于口蹄疫病毒近些年流行毒的突变发生频率越来越高，而市售试剂盒仅能涵盖较少毒株，因而已经不能满足对现有毒株的检出率，为了克服这一缺陷，本试验针对口蹄疫O型3个拓扑型（CATHAY、ME-SA型和SEA型），采用生物信息学方法对VP1序列进行精确分析，筛选出3条肽，制备出更新更全的包被抗原，建立了牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法，为进一步研发牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒奠定基础。

1　材料与方法

1.1包被抗原分别为来自CATHAY、ME-SA和SEA三个拓扑型VP1结构蛋白的表位（位于氨基酸140～160区域），由中牧实业股份有限公司研究院合成并纯化。

1.2主要试剂兔抗牛IgG酶标二抗，购自Sigma公司；其他试剂，购自Amresco公司；牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒，购自上海优耐特生物医药公司（UBI）；口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所（LVRI）。

1.3血清牛口蹄疫O型阴、阳性对照血清由本公司制备；100份牛口蹄疫O型病毒感染牛血清，50份牛口蹄疫O型疫苗免疫血清，100份健康牛血清（口蹄疫抗体为阴性），276份牛临床血清由兰州生物药厂提供；牛口蹄疫亚洲1型阳性血清和牛口蹄疫A型阳性血清各5份，由本公司制备。

1.4最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

采取方阵滴定方法，用包被液将合成肽包被抗原分别作8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL/肽，倍比稀释；将阳、阴性血清从1∶10、1∶20稀释至1∶320，比较P/N值（P：阳性对照孔OD450值；N：阴性对照孔OD450值），以P/N值最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。

1.5最佳封闭条件的确定分别用含0.2%、1% BSA、0.5%和5%脱脂奶粉的0.01%Tween-20 PBS （0.01 mol/L，pH值7.2）作为封闭液，进行ELISA检测，比较P/N值，以P/N值最大孔对应封闭液配方作为最佳封闭液。

1.6底物反应时间的确定分别置37℃孵育10、15 min及20 min，比较P/N值，以确定底物最佳反应时间。

1.7临界值的确定对100份健康牛血清进行测定，根据健康动物血清样本OD450平均值（X）加上3个标准差（SD）得出试剂盒临界值。

1.8敏感性试验对100份感染牛血清和50份免疫牛血清进行检测。

1.9特异性试验对100份健康牛血清、牛口蹄疫亚洲1型阳性血清、牛口蹄疫A型阳性血清各5份分别进行检测。

1.10重复性试验用同一批次包被酶标反应板和相应试剂，分别检测已知背景15份血清样本，其中阴性、强阳性和弱阳性血清各5份，计算批内变异系数。用3批包被酶标反应板和相应试剂，分别检测已知背景15份血清样本，计算批间变异系数。

1.11比对试验对276份临床血清分别用本方法、UBI和LVRI试剂盒进行比对试验。

2　结果与分析

2.1最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定结果显示（表1）抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL/肽，血清最佳稀释度为1∶20。

表1　方阵滴定结果（P/N比值）

2.2最佳封闭条件的确定结果显示（图1）含有1%BSA、0.01%Tween-20的PBS封闭效果最好。

图1　封闭液的确定

2.3待检血清最佳反应时间的确定结果显示（图2），加入待检血清反应60 min后，P/N值最高。

2.4临界值的确定所测得100份健康牛血清平均OD450值（X）为0.141，标准方差（SD）值为0.041，X+3SD=0.264。≥0.264判为阳性；＜0.264判为阴性。利用该Cut-off值判定这100份健康牛血清，仅有2份血清为阳性，因而确定的临界值可靠。

2.5敏感性试验本方法对100份感染牛血清和50份免疫血清进行检测（见表2），其中145份血清为阳性，5份血清为阴性，敏感性为96.7%。

图2　血清反应时间的确定

表2　试剂盒敏感性和特异性试验结果

2.6特异性试验本方法对100份健康牛血清检测仅有1份为阳性，对牛亚洲1型阳性血清和牛A型阳性血清均为阴性（表3），特异性为99.1%（109/110）。

表3　试剂盒重复性试验结果

2.7重复性试验批内重复性结果显示，批内变异系数在2.1%～9.8%之间。批间重复性结果显示，批间变异系数在3.5%～10.7%之间，表明该试剂盒重复性较好。

2.8比对试验对276份临床血清进行检测，本方法阳性检出率为37.0%。UBI试剂盒阳性检出率为36.2%。两者共有258份血清检测结果一致，符合率为93.5%。LVRI试剂盒阳性检出率为40.2%。两者总共有237份血清检测结果一致，符合率为85.9%。

表4　与其他试剂盒比对试验结果

3　讨论

目前OIE公布的口蹄疫感染和疫苗免疫后抗体检测的血清学检测方法有3种：液相阻断ELISA、病毒中和试验、固相竞争ELISA。其中以病毒中和试验最为经典，是评价疫苗效果和检验其他方法的“金标准”，但操作繁琐，且涉及活病毒，对实验室生物安全和操作人员要求较高。液相阻断ELISA目前是大多数国家广泛使用的方法，然该方法需对血清作至少4个稀释度，每块板最多检测20份血清，且操作繁琐。本试验建立的方法操作简便适合大批量检验，包被抗原为合成肽，无需接触和使用病毒，无生物安全隐患。其次合成肽是FMDV外壳蛋白VP1抗原决定簇序列，与相应抗体的结合力强，决定了本方法检测的敏感性。并且合成肽是短肽，与其他非特异性抗体的交叉反应性较低［3］，因此该方法在高效、特异、快捷及生物安全性上实现了较完美的结合。试验结果证明，该方法敏感性高、特异性好、重复性好，符合市场要求，可用于牛口蹄疫病毒O型抗体检测，为进一步研发相应试剂盒奠定了基础。

参考文献：

［1］Alexandersen S，Zhang Z，Donaldson A I，et al.The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease［J］.J Comp Pathol，2003，129 （1）：1-36.

［2］Acharya R，Fry E，Stuart D，et al . The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution［J］. Nature，1989，337（6209）：709-716.

［3］Wang C Y，Chang T Y，Walfield A M，et al.Effective syntheticpeptide vaccine for foot and mouth disease in swine［J］. Vaccine，2002：2603 -2610.

Development of an ELISA based on synthetic peptidefor detection of cattlefoot- and- mouth diseasevirus type O VP1 antibody

ZHANG Lei1，XIAO Jin1，2，DONG Chun-na1，BA Li-min1，LI Li-fang1，SONG Fang1，WANG Nan1，ZHOU Qiang1，QI Peng1，WANG Ming1，2

Key words：cattle；FMDV；synthetic peptide；ELISA

Abstract：Three synthetic peptides of FMDV VP1 were used to detect antibody of FMDV type O.The ELISA system was optimized and the sensitivity，specificity and repeatability of this method were tested.The results showed that the sensitivity and specificity were 96.0%and 99.1%，and variations of intra-and inter-assay repeatability were 2.1%～9.8%and 3.5%～10.7%.Comparing this method with 2 test kits showed a coincidence rate of 93.5%and 85.7%.The results show that this method has high sensitivity and specificity，and is stable，which can be used to monitor VP1 antibody.

中图分类号：S858.23

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0022- 03

收稿日期：2014-12-26

作者简介：张蕾（1984-），女，兽医师，博士，从事动物免疫学研究，E-mail：zhanglei1984cau@163.com

通讯作者：齐鹏，E-mail：cahic_ivd@vip.tom.com

Corresponding author：QI Peng