鸡包涵体肝炎病毒荧光定量PCR滴度测定方法的建立及与不同滴定方法间的比较

李昌静，王作昭，王静静，刘永举，张　毅，毕玉敏，王冬冬，陈文雅，尹燕博，（.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛6609；.吉林大学军需科技学院，吉林长春006；.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛660；.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛6609；.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛660）



鸡包涵体肝炎病毒荧光定量PCR滴度测定方法的建立及与不同滴定方法间的比较

李昌静1，王作昭2，王静静3，刘永举4，张毅3，毕玉敏1，王冬冬1，陈文雅5，尹燕博1，5
（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；2.吉林大学军需科技学院，吉林长春130062；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；4.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109；5.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛266101）

摘要：本试验根据GenBank中I群禽腺病毒（FAV-Ⅰ）代表株AAU46933（CELO株）的Hexon基因序列设计一对通用引物，摸索了合适的扩增条件，建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法，并对9株鸡包涵体肝炎毒株的病毒滴度进行了测定，并与OD260法、鸡胚病变法以及细胞病变法测定的结果进行比较。试验结果表明，本方法的检测下限为0.98×102拷贝/μL。以细胞病变法为标准测定方法，经统计学分析发现，鸡胚病变法与细胞病变法之间无统计学差异（P=0.591）；荧光定量PCR法与细胞病变法测得结果之间存在线性相关性（相关系数r=0.965，P＜0.05）；OD260法与细胞病变法测得的结果间无相关性（P＞0.05）。以上结果说明，荧光定量PCR法测定结果能够间接反映病毒感染力，与传统方法相比，该方法操作简单、耗时短、成本低，具有较高的应用价值。

关键词：鸡；包涵体肝炎病毒；荧光定量PCR

王作昭（1979-），男，实验师，硕士，从事食品科学及安全相关科研工作，E-mail：zouzhaowang@163.com

注：王作昭与李昌静对本文具有同等贡献

鸡包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis in chicken，IBH）是由Ⅰ群禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV-Ⅰ）引起的鸡的一种急性病毒性传染病，主要侵害雏鸡，多呈急性经过。该病首次由美国Helmbold和Frazier（1963）报道，我国于1976年首先在台湾省发现该病，随后在辽宁、山东、内蒙古等省相继发现IBH流行，现在该病已成为危害养禽业发展的重要传染病之一。目前，已有很多关于鸡包涵体肝炎病毒检测方法的报道，但对于该病毒定量测定的方法却少有报道。

本试验建立了鸡包涵体肝炎病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，并与该病毒常用的几种定量测定方法如OD260法、TCID50法、EID50法等进行比较，以期对鸡包涵体肝炎的生物学特性研究提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料鸡包涵体肝炎分离株（09CX、09LT-11、09DD、09XT、09WF、10JL-17、10DX、10SSY、12TS）由本实验室分离并保存；SPF种胚，购自山东省无特定病原鸡实验种鸡场；pMD19-FAV1-T质粒由本实验室保存。

病毒核酸提取试剂盒，购自北京全式全生物科技有限公司；FS UniversaⅠSYBR Green Master荧光定量试剂，购自罗氏公司；病毒纯化试剂盒，购自Biomiga公司；DMEM培养基、胎牛血清，购自GIBCO公司；DNase，购自NEB公司；Taq酶，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2方法

1.2.1鸡包涵体肝炎病毒的纯化鸡包涵体肝炎毒株09CX、09LT-11、09DD、09XT、09WF、10JL-17、10DX、10SSY、12TS在CEK上增值，细胞反复冻融3次后收集病毒液。按照腺病毒纯化试剂盒步骤和要求纯化病毒，后经磷钨酸负染，电镜下观察病毒形态。

1.2.2荧光定量PCR法

1.2.2.1引物设计与合成根据GenBank中FAV-Ⅰ代表株AAU46933（CELO株）的Hexon基因序列，应用Premier 5.0设计的Ⅰ群禽腺病毒通用引物（由上海华大公司合成）正向F：5′-ATGACTGCGCTTACTCCCGACCTG-3′反向R：5′-GCTACGACCGTCTGCCTGAATTTGT-3′引物合成后以DEPC处理水稀释为25 nmol/mL的工作浓度。

1.2.2.2病毒核酸的提取与标准品的制备50倍稀释病毒，按照NEB公司的DNA酶灭活步骤对裸露的DNA进行灭活。按照北京全式全生物技术有限公司病毒核酸提取试剂盒步骤提取病毒核酸。测定pMD19-FAV1-T质粒浓度，将质粒从10-2开始10倍梯度稀释至10-8作为标准品，检测引物的扩增效率。

1.2.2.3荧光定量PCR按罗氏公司FS UniversaⅠSYBR Green Master试剂盒的说明书配制25 μL反应体系，每个样品均设3个重复，阴性对照组以dH2O代替。反应条件为：50℃2 min，95℃10 min，1个循环；95℃15 s、60℃1 min，40个循环。依公式：病毒基因组拷贝数/mL（μg/mL）=（病毒核酸拷贝数/μL）× （50 μL/200 μL）×1 000 μL×稀释度，计算每mL病毒液中病毒基因组拷贝数。

1.2.3 OD260法测定病毒颗粒总数将病毒进行梯度稀释，以分光光度计测260 nm吸光度值。依公式：病毒颗粒/mL=OD值×稀释倍数×1012计算病毒颗粒总数。

1.2.4 TCID50测定

1.2.4.1原代鸡胚肾细胞（CEK）的培养取17～20日龄的SPF鸡胚，按常规方法制备原代鸡胚肾细胞［1］。

1.2.4.2病毒接种将病毒梯度稀释至10-3～10-1210个梯度，每列1个稀释度，最后两列作空白对照。37℃，5%CO2培养5 d。每天观察细胞病变情况。记录病变情况，按Reed-Muench两氏法计算病毒滴度［3］，并以感染单位/100 μL（IFU/100 μL）表示。

1.2.5 EID50测定病毒液10倍梯度稀释，卵黄囊接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚，作5个重复［2］，同时设阴性对照。置37℃温箱孵育24 h剔除死胚，收获48 h以后死胚及19日龄未死胚。将死胚和具特征性病痕的未死胚计入总数［3］。按Reed-Muench两氏法计算病毒滴度，以感染单位/200 μL （IFU/200 μL）表示。

1.2.6荧光定量PCR法与普通PCR灵敏度的比较2×106拷贝/μL的pMD19-FAV1-T质粒10倍递减稀释，参照文献［10］中的引物、反应体系和程序进行常规PCR。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.7统计学分析应用SPSS19.0软件对4种方法测定9种鸡包涵体肝炎病毒滴度的结果进行统计学分析。用One-way ANOVA比较不同方法间的差异，对于有显著差异的方法，再用线性相关分析比较其与鸡胚病变法的相关性。

2　结果

2.1鸡包涵体肝炎病毒纯化病毒纯化后，经磷钨酸负染，电镜下可观察到大量呈典型晶格状排列的病毒粒子，圆形或六角形，无囊膜，直径60～90 nm，呈二十面体对称结构，与鸡包涵体肝炎病毒特征一致，没有观察到其他病毒，说明病毒纯化成功。

2.2荧光定量PCR法测定病毒基因组拷贝数所有pMD19-FAV1-T质粒标准品均扩增良好，所得标准曲线准确（图1）。标准曲线有效范围为：0.97×102～3.12×1011。测得样品Ct值，根据标准曲线计算公式：Ct=-3.17lgC+41.31，得出对应病毒液中核酸拷贝数。测得9株鸡包涵体肝炎病毒Ct值，根据标准曲线计算公式测得病毒核酸拷贝数。依换算公式得9种病毒的滴度，见表1。

2.3荧光定量PCR法与普通PCR灵敏度的比较

从各稀释度质粒的常规PCR电泳结果可看出，该方法的检测下限为2×104个拷贝（图2）。本试验建立的方法检测下限为0.98×102拷贝（图1），比常规PCR的敏感性高100倍左右。

2.4OD260法测定病毒颗粒总数将9株鸡包涵体肝炎病毒做100倍或1 000倍稀释，测定其260 nm吸光度值。按公式计算得每毫升病毒液中病毒颗粒数，见表1。

2.5TCID50测定病毒滴度观察细胞形态变化，从接毒后48 h开始每天观察并记录病变孔数。按Reed-Muench法公式计算病毒滴度，换算成IFU/mL，见表1。

表1　不同方法测定鸡包涵体肝炎病毒滴度结果比较

图2　常规PCR敏感性检测M：DNA分子量标准；1～6：pMD19-FAV1-T质粒从2×106拷贝/μL 10倍递减到10拷贝/μL

2.6EID50测定病毒滴度观察鸡胚变化，记录不同毒株的死胚和具有鸡包涵体肝炎特征性病痕的未死胚。按Reed-Muench法公式计算病毒滴度，换算成IFU/mL，见表1。

2.7不同方法测定结果的统计学分析应用SPSS19.0软件对4种方法测定结果进行统计学分析，EID50法与TCID50法之间无统计学差异（P= 0.591）。荧光定量PCR法和OD260法与其他2种方法统计学上有显著差异（P＜0.05）。应用线性相关分析得知，荧光定量PCR与TCID50法测得结果之间有线性相关（相关系数r=0.965，P＜0.05）。OD260法测得结果与其他任一种方法测得结果均无相关性（P＞0.05）。

2.8不同测定结果的实用性比较综合上述4种方法测定的结果，我们将各种方法的实用性进行了汇总分析，见表2。

表2　不同方法间实用性比较

3　讨论

定量测定鸡包涵体肝炎病毒的方法主要分为两大类：

第一类是对病毒的颗粒数进行物理学定量的方法，以OD260法和荧光定量PCR法为主［4］。OD260法操作简单，但所测得的结果仅反映了单位体积病毒液里总的病毒颗粒数［5］，而在所测的颗粒中，包含有缺陷病毒颗粒［6］，这些缺陷病毒颗粒大量存在，且其数量与鸡包涵体肝炎病毒的结构、病毒扩增的操作过程等诸多因素有关，并无固定的比例，这导致了OD260法所测得的结果与病毒的实际感染力无明显相关性，不能真实反映鸡包涵体肝炎病毒的实际感染力，故应用价值有限。荧光定量PCR方法是通过荧光定量的方法对模板拷贝数进行精确的定量［7］，且提取病毒核酸之前先对病毒进行了灭活DNA的处理，除去了裸露的DNA，故该方法所测得的病毒核酸拷贝数较精确地反映了病毒保存液中总的完整病毒颗粒数［8］。因为并非所有的完整病毒颗粒均具有感染力，所以该法所测得的结果与病毒的实际感染效力仍不尽相同。在我们实验所得结果中，荧光定量PCR法测得的病毒拷贝数显著高于以细胞病变法为代表的测定感染性滴度的方法所测得的结果［9］。但该法所测得的病毒拷贝数与常用的细胞病变法测定的病毒有效感染颗粒数之间存在着线性关系，这在一定程度上能够间接反映出具有感染能力的病毒颗粒的数量。

第二类是反应病毒实际感染力的方法。细胞病变法是测定鸡包涵体肝炎病毒滴度的传统方法。鸡胚病变法和细胞病变法测定的均为感染性滴度，二者单位的意义是一致的。两种方法测定结果在统计学上无显著差异。而在实际操作的过程中，细胞病变法因主要依靠显微镜下观察细胞感染鸡包涵体肝炎病毒后的形态学上的改变，作为判定病变的依据，故造成了该法测定结果的稳定性和可重复性较差［5］，加之是原代细胞接毒，耗时较长（24～26 d），影响后续试验的进行。鸡胚病变法主要通过记录死胚数和观察未死胚胚体和肝脏的特征性病痕，作为判定感染的依据，相对于细胞病变法，它的判定结果更准确。

荧光定量PCR除了可较精确地测定完整病毒颗粒的数量外，还可以作为检测鸡包涵体肝炎病毒的一种手段。与常规PCR相比，前者敏感性更高，是后者的100倍，且全过程仅需2 h，大大缩短了检测病毒的时间。

从表2可以看出，荧光定量PCR法和鸡胚病变法所测得的结果均较为准确，可重复性好，样本处理简单。但鸡胚病变法耗时较长（19 d）、成本高，而荧光定量PCR方法速度更快，更敏感。

综上所述，本试验建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法能够更准确地测定样本中鸡包涵体肝炎病毒颗粒的数量，与其他常用的几种方法相比，具有更敏感、速度更快、耗时更短等优点。除此之外，本方法还可以用于临床样本中鸡包涵体肝炎病毒的检测，与常规PCR相比，该方法更敏感、速度更快。

参考文献：

［1］缪从容，吴贤福.几种鸡胚原代细胞的制备方法［J］.中国兽药杂志，1997，31（1）：14-16.

［2］尹成杰，于康震.中华人民共和国兽药典［M］.3卷.北京：中国农业出版社，2010：137.

［3］尹成杰，于康震.中华人民共和国兽药典［M］.3卷.中国农业出版社，2010：48.

［4］Nyberg-Hoffman C，Shabram P，Li W，et al.Sensitivity and reproducibility in adenoviral infectious titer determination［J］.Nat Med，1997，3（7）：808-11.

［5］张艳玲，刘然义，柯妙拉，等.壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价［J］.中国病理生理杂志，2005，21（4）：830-3.

［6］Tian B，Wu B，Zhang Q W，et al.Producing recombinant adenovirus encoding green fluorescent protein（Ad-GFP）by suspension cultured HEK-293 N3S cells［J］.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2007，23（5）：915-8.

［7］Atkinson E M，Debelak D J，Hart L A，et al.A high-throughput hybridization method for titer determination of viruses and gene therapy vectors［J］.Nucleic Acids Res，1998，26（11）：2821-3.

［8］Thomas M A，Lichtenstein D L，Krajcsi P，et al . A real-time PCR method to rapidly titer adenovirus stocks［J］. Methods Mol Med，2007，130：185-92.

［9］Ma L，Bluyssen H A，De Raeymaeker M，et al.Rapid determination of adenoviral vector titers by quantitative real-time PCR［J］.J Virol Methods，2001，93（1-2）：181-8.

［10］李海英，尹燕博，郭妍妍，等.12株肉仔鸡包涵体肝炎病毒的分离和PCR鉴定［J］.中国兽医科学，2010，40（7）：551-556.

Development of a real- time PCR method for determination of chicken inclusion body hepatitis virus titer and comparativeanalysis between different methods

LI Chang-jing1，WANG Zuo-zhao2，WANG Jing-jing3，LIU Yong-ju4，ZHANG Yi3，BI Yu-min1，WANG Dong-dong1，CHEN Wen-ya5，YIN Yan-bo1，5
（1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Military science and technology college of jilin university，changchun 130062，China；3.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266001，China；4.College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；5.Qingdao Oland-Better Biological Engineering company，Qingdao 266001，China）

Abstract：To establish a simple and convenient method for determination of chicken inclusion body hepatitis virus，the realtime PCR was developed with a pair of universal primers referencing Hexon gene of the CELO strain，and the amplifying condition was groped.Nine chicken inclusion body hepatitis virus strains were titrated by both the established real-time PCR method，and other three determination methods（optical absorbance，mbryonated infectious dose，and cytopathic effect）.Our results showed that the detection limit of this method was 0.98×102copies/μL.There was no statistical differences（P=0.591）between embryonated infectious dose and cytopathic effect.However，linear relations existed，between the determination results of real-time PCR and cytopathic effect（coefficient of association r=0.965，P＜0.05）.These results indicate that the determination using real-time PCR method can reflect the virus infectivity indirectly，has the advantage of simple operation，timesaving，and low cost compared with traditional method，and has a high application value.

Key words：Chicken；inclusion body hepatitis virus；real-time PCR

中图分类号：S858.31

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0044- 03

收稿日期：2014-08-14

基金项目：山东省自然科学基金（ZR2010CM014）；山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队（SDAIT-13-011-03）

作者简介：李昌静（1987-），女，硕士，主要从事兽医病理学及其分子生物学研究，E-mail：lichangjing2007_@126.com

通讯作者：尹燕博，E-mail：yanboyin2011@163.com

Corresponding author：YIN Yan-bo