麦角甾醇过氧化物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制试验

高　丽，王君篪，斯建勇，曹　丽（中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京海淀100193）



麦角甾醇过氧化物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制试验

高丽，王君篪，斯建勇，曹丽
（中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京海淀100193）

摘要：为了研究麦角甾醇过氧化物（ergosterol peroxide，PE）抑制PRRSV的活性，在体外用猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a毒株感染Marc-145细胞，在病毒感染的同时加入不同浓度的PE，24 h后固定细胞用间接免疫荧光检测细胞内的病毒N蛋白，同时收集细胞培养上清检测病毒滴度，结果显示，PE可剂量依赖性地抑制PRRSV在细胞中复制。分别用PE预处理病毒或细胞，结果发现，病毒与PE共孵育并不会抑制病毒感染细胞活性，而PE预处理细胞则会抑制病毒在细胞中复制。表明PE通过作用于宿主细胞而抑制PRRSV在体外细胞中复制，为进一步开发利用PE提供了基础。

关键词：过氧麦角甾醇；猪繁殖与呼吸综合征病毒；抗病毒

1987年首次报道猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以来，人们做了大量研究工作以控制和消除PRRS。但目前使用的商品化的疫苗并不能有效地预防和控制PRRSV。已有报道证实一些天然化合物或者组分具有抑制PRRSV的功能，比如磺酸钠和板蓝根多糖等能在体外Marc-145细胞上有效地抑制PRRSV复制［1］。

麦角甾醇过氧化物（ergosterol peroxide，PE）广泛存在于珊瑚［2］以及蘑菇，如灵芝［3］，平菇［4］，红汁乳菇［5］和桦褐孔菌［6］中。PE具有多种生物活性，包括体外抗肿瘤［5］、促凋亡［7］、抗炎［6］等活性。我们之前的研究发现，隐孔菌提取物在体内和体外具有抗PRRSV活性。从隐孔菌中分离提取到了大量PE，然而PE是否具有抗PRRSV的活性，目前罕见文献报道，因此在本文中我们对PE抑制PRRSV的活性和机制进行了研究。

1　材料与方法

1.1Marc-145细胞系与PRRS病毒毒株CH-1a （GenBank序列号：AY032626）由中国农业大学封文海教授馈赠，细胞培养基DMEM，青霉素/链霉素双抗，0.25%胰酶-EDTA，胎牛血清，购自迈晨科技（北京）有限公司；鼠抗PRRSV N蛋白单抗（SDOW-17），购自Rural Technologies公司；MTT试剂，购自Sigma公司；Real-Time相关试剂，购自北京康维世纪生物科技有限公司。

1.2间接免疫荧光吸弃细胞培养液，PBS洗1次，然后用固定液（冷甲醇丙酮1∶1）4℃固定细胞10 min；吸弃固定液，用PBS洗两次，5%山羊血清37℃封闭30 min；吸弃上清，加抗PRRS病毒N蛋白的一抗SDOW17（1∶10 000）稀释，37℃孵育1 h吸弃上清，PBS洗3次；加FITC标记的兔抗鼠二抗，37℃避光1 h；吸弃上清，PBS洗3次；荧光显微镜下观察病毒阳性孔。

1.3MTT将细胞接种到96孔板，37℃，5%CO2环境下培养24 h；用培养液稀释化合物，以等体积的DMSO做溶剂对照；吸弃细胞培养液，加入含有PE或DMSO的培养液，37℃，5%CO2环境下培养48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，37℃孵育10 min，使结晶物充分融解。用酶标仪在550 nm波长处测吸光度，以对照组细胞存活率为100%，计算试验组细胞存活率。

1.4病毒感染抑制试验将Marc-145细胞接种到96孔板，于37℃和5%CO2环境下培养24 h。接种PRRSV毒株CH-1a（MOI=0.01），病毒感染的同时加入不同浓度的PE或10 units/mL的IFN-α，37℃，5% CO2环境下培养24 h，收集上清测定病毒TCID50。同时固定细胞，做间接免疫荧光试验。

2　结果

2.1PE抑制PRRS病毒在细胞中复制如图1所示，与DMSO对照相比，当PE的浓度在40 μg/mL时，病毒滴度下降了大约10倍，而在PE浓度为80 μg/mL时，病毒滴度下降了大约100倍。PE在Marc-145细胞抑制CH-1a毒株复制的50%有效浓度（EC50）是27.14 μg/mL。

图1　PE抑制PRRSV CH- 1a毒株在Marc- 145细胞中复制A：间接免疫荧光检测细胞内病毒；B：PE降低细胞培养上清中的病毒滴度（TCID50）

2.2MTT试验确定PE对Marc-145细胞的毒性为了排除PE细胞毒性对病毒复制干扰的影响，用MTT试验检测了Marc-145细胞在不同浓度PE存在下的存活率，如图2所示，PE对Marc-145细胞的CC50是277 μg/mL，远远超过了EC50值，PE对于CH-1a感染Marc-145细胞的治疗指数（CC50/EC50）为10.3。

2.3初步确定PE的作用靶点为了研究PE是否直接杀伤病毒，将病毒与PE共孵育，然后测定病毒TCID50，结果（图3A）发现，与对照相比，PE并不能明显降低病毒滴度。而将PE预处理细胞2 h，再用病毒感染细胞（MOI=0.01），DMSO对照组病毒滴度平均值为105.3TCID50/mL，而PE预处理组，病毒滴度则下降到104.1TCID50/mL，与对照组相比，下降了16倍（图3B）。

图2　MTT法确定PE对Marc－145细胞的毒性

图3　PE作用靶点初步分析A：PE对PRRS病毒颗粒的直接杀伤作用；B：PE预处理细胞抑制PRRSV在细胞中复制

3　讨论

隐孔菌是一种野生大型真菌，在传统中医药中多用于治疗气管炎和哮喘［8］。我们前期研究发现，隐孔菌子实体的水提取物对于PRRSV体内和体外感染具有强烈的抑制功能［9］。但是水提取物是一种粗提物，而粗提物的活性容易受药材质量及提取过程的影响，因此我们进一步研究了隐孔菌提取物抑制PRRSV复制的有效成分，发现来自于隐孔菌的麦角甾醇过氧化物（PE）在体外Marc-145细胞上能显著地抑制PRRSV Ch-1a复制，初步机制研究表明，PE主要通过作用于细胞而抑制病毒感染。

马增强等人结合现代色谱纯化技术和免疫荧光技术分离到一个来自隐孔菌的新化合物CM-H-L-5，其具有抑制PRRSV体外复制的活性［10］，但他们的结果也显示，CM-H-L-5并不是隐孔菌提取物中的惟一活性成分。与马增强等人报道的来自化合物CM-H-L-5相比，PE具有更强烈的体外抑制病毒复制活性（EC50为27.14 μg/mL）。病毒抑制剂的作用机制通常有两种，一种是靶向病毒，另一种是靶向细胞。尽管我们初步研究表明，PE主要通过作用于细胞而抑制病毒复制，但是PE究竟怎样抑制宿主细胞的功能还需进一步研究。

参考文献：

［1］Karuppannan A K，Wu K X，Qiang J，et al.Natural compounds inhibiting the replication of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Antiviral Res，2012，94（2）：188-194.

［2］Deghrigue M，Festa C，Ghribi L，et al.Pharmacological evaluation of the semi-purified fractions from the soft coral Eunicella singularis and isolation of pure compounds［J］.Daru，2014，22：64.

［3］Wu Q P，Xie Y Z，Deng Z，et al.Ergosterol peroxide isolated from Ganoderma lucidum abolishes microRNA miR-378-mediated tumor cells on chemoresistance［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44579.

［4］Ramos-Ligonio A，Lopez-Monteon A，Trigos A，Trypanocidal activity of ergosterol peroxide from Pleurotus ostreatus［J］.Phytother Res，2012，26（6）：938-943.

［5］Gao J M，Wang M，Liu L P，et al.Ergosterol peroxides as phospholipase A（2）inhibitors from the fungus Lactarius hatsudake［J］. Phytomedicine，2007，14（12）：821-824.

［6］Ma L，Chen H，Dong P，et al.Anti-inflammatory and anticancer activities of extracts and compounds from the mushroom Inonotus obliquus［J］.Food Chem，2013，139（1-4）：503-508.

［7］Kobori M，Yoshida M，Ohnishi- Kameyama M，et al.Ergosterol peroxide from an edible mushroom suppresses inflammatory responses in RAW264.7 macrophages and growth of HT29 colon adenocarcinoma cells［J］.Br J Pharmacol，2007，150（2）：209-219.

［8］Zhao L X，Xu L H，Jiang C L，Methods for the study of endophytic microorganisms from traditional Chinese medicine plants［J］.Methods Enzymol，2012，517：3-21.

［9］Gao L，Zhang W，Sun Y，et al.Cryptoporus volvatus extract inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in vitro and in vivo［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63767.

［10］Ma Z，Zhang W，Wang L，et al.A novel compound from the mushroom Cryptoporus volvatus inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in vitro［J］.PLoS One，2013，8（11）：e79333.

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0047- 02

收稿日期：2016-01-25

基金项目：中国医学科学院药用植物研究所创新团队项目

作者简介：高丽（1986-），女，助理研究员，博士，从事抗病毒天然产物的筛选与机制研究，E-mail：lgao@implad.ac.cn

通讯作者：曹丽，E-mail：lcao@implad.ac.cn