东莞市屠宰场环境及屠宰猪体内致病性大肠杆菌的分离与鉴定

徐振娜，洪伟彬，李永福，钟群芳，刘　芳（广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523086）



东莞市屠宰场环境及屠宰猪体内致病性大肠杆菌的分离与鉴定

徐振娜，洪伟彬，李永福，钟群芳，刘芳
（广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523086）

大肠杆菌（E.coli）为埃希菌属（Escherichia）代表菌。为人和动物肠道中的常在菌，在其被发现的很长一段时间内，认为是非致病菌。直到20世纪中叶才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，统称为致病性大肠杆菌。根据不同的生物学特性，将致病性大肠杆菌分为5类：肠致病性大肠杆菌（ETEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）。其中EHEC由于毒力强、致病性高而受到广泛关注。目前大肠杆菌已成为食源性疾病的重要病原之一，食品污染是导致大肠杆菌疫情最常见的原因。2011年，德国由食用毒蔬菜引发的出血性肠炎暴发疫情。包括德国在内的欧盟与欧洲经济区成员国通报的病例数达4 023例，其中并发溶血性尿毒综合征（HUS）病例885例，非HUS病例3 138例，死亡48例［1］。

我国是猪肉生产消费大国，猪肉一直在我国大多数地区居民肉禽类消费结构中占据绝大的比重。我市每天有1万多头生猪经屠宰场屠宰后流向市民餐桌，生猪待宰和屠宰的过程极易受到致病性大肠杆菌的污染，而市民吃了这些被污染的猪肉容易引起食物中毒，因此屠宰场地环境及屠宰猪的致病性大肠杆菌进行监测非常有必要。本试验采集东莞市32个镇街生猪屠宰场的环境、污水和屠宰猪体内样品，进行致病性大肠杆菌的分离鉴定。通过全市范围内的摸底调查，得到东莞市致病性大肠杆菌的感染流行情况的可靠数据，为监管部门制定下一步防控措施提供参考。

1　材料与方法

1.1材料伊红美蓝培养基、大肠杆菌O157显色培养基、缓冲蛋白胨水、营养琼脂、革兰染色液、大肠杆菌IMVC生化鉴定盒、致泻大肠埃希菌生化鉴定盒、大肠埃希菌O157：H7生化鉴定盒、血平板、90 mm玻璃培养皿等，均购自广州环凯微生物科技有限公司；肠道致病性大肠埃希菌诊断血清、肠道侵袭性大肠埃希菌诊断血清、肠道产毒性大肠埃希菌诊断血清、大肠埃希菌H7诊断血清等，均购自宁波天润生物药业有限公司；大肠杆菌O157：H7荧光PCR检测试剂盒，购自深圳太太基因工程有限公司。超净工作台，生物安全柜，离心机，显微镜。

1.2样品每个屠宰场猪肝样品10份（共320份）；污水水样3份（共96份）；环境空气5份（共160份）；屠宰用具、工作台、地板等涂抹拭子3份（共96份）。

1.3采样方法

1.3.1猪肝猪屠宰后，无菌采集猪肝样品100 g，冷藏运送至实验室待检。

1.3.2空气样品采用沉降法。根据现场的大小，选择有代表性的位置作为环境空气细菌检测的采样点。室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外3点；室内面积超过30 m2，设置5个采样点，即室内墙角对角线交点为1个采样点，该交点与四墙角连线的中点为另外4个采样点。

将已制备好的营养琼脂培养平皿置采样点，放置时需离地0.8～1.5 m，远离墙壁1 m以上，并避开空调、门窗等空气流通处。打开培养皿盖，使培养基表面暴露30 min，再将培养皿盖盖上后倒置。

1.3.3污水样品以灭菌后的10 mL EP管在每个屠宰场分3个点采污水，每个点10 mL左右。

1.3.4场地及器具以高压灭菌后的棉拭子反复在屠宰器具、工作台、地板等表面檫拭，然后将带菌棉签放入装有10 mL生理盐水的EP管中，充分振荡后冷藏备用。

1.4细菌分离

1.4.1肝脏样品无菌取肝脏样品25 g进行前增菌，具体方法参考GB/T4789.6-2003。同时取可疑菌落划线接种于大肠杆菌O157：H7显色培养基，37℃培养18 h～24 h。

1.4.2空气样品在普通琼脂平皿中选取圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明、隆起菌落接种于前增菌肉汤，具体方法参考GB/T4789.6-2003。同时划线接种于大肠杆菌O157：H7显色培养基，37℃培养18 h～24 h。观察平板上生长的菌落。

1.4.3水样及器具拭子取1 mL水样或拭子液进行前增菌，具体方法参考GB/T4789.6-2003。同时取可疑菌落划线接种于大肠杆菌O157：H7显色培养基，37℃培养18 h～24 h。

1.4.4细菌鉴定挑取平板上的可疑菌落进行革兰染色、镜检，并进行生化鉴定和血清学试验。具体方法参考GB/T4789.6-2003。

1.4.5肠出血性大肠杆菌O157分离鉴定取前增菌菌液1 mL用裂解法提取DNA，进行PCR扩增。每反应管加PCR反应液22.5 μL，Taq酶0.5 μL，UNG 酶0.06 μL，模板2 μL。荧光PCR反应程序：37℃，5 min，1个循环；95℃，3 min，1个循环；95℃5 s，60℃40 s（收集荧光），40个循环。反应体系为25 μL。荧光信号设为FAM荧光素。取荧光PCR阳性样品菌液1环划线接种大肠杆菌O157显色平板，37℃培养18 h～24 h，挑取可疑菌落进行生化鉴定。

1.5血清型鉴定按照宁波天润生物药业有限公司提供的试剂盒说明书进行操作。

2　结果

2.1细菌分离挑取在伊红美蓝平板上呈深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落和在大肠杆菌O157显色平板上呈紫红色、扁平透明、边缘光滑、直径约2 mm的可疑菌落进行革兰染色。经革兰染色、镜检可见革兰阴性、散在或成对排列、两端钝圆的短杆菌。

2.2大肠杆菌O157生化鉴定挑取荧光PCR阳性的菌液划线接种于显色培养基，培养后挑取显色培养基上的可疑菌落进行生化鉴定（表1），符合以下生化反应的菌株再进行平板凝集试验进行确认，共分离到78株大肠杆菌O157：H7，具体结果见表2。

表1　大肠杆菌O157的生化特征

表2　肠出血性大肠杆菌O157：H7分离鉴定结果

2.3其他致病性大肠杆菌的分离与鉴定通过生化试验及血清学试验，共分离到其他致病性大肠杆菌70株，具体结果见表3。

表3　其他致病性大肠杆菌分离鉴定结果

2.4血清型鉴定通过玻板凝集试验，其中60株致病性大肠杆菌的血清型分属于12个血清型。其中O138、O9、O8为主要血清型，另有10株未定型。具体结果见表4。

表4　致病性猪大肠杆菌O抗原血清型鉴定结果

3　讨论

鉴于致病性大肠杆菌对养殖业及人类健康的严重危害性，本研究从屠宰场屠宰猪及外环境采样，进行致病性大肠杆菌的分离与鉴定。共分离到肠出血性大肠杆菌O157：H778株，其他致病性大肠杆菌70株，其中O138、O9、O8为主要血清型。从结果来看，无论是在屠宰猪还是屠场的周围环境、空气等，大肠杆菌O157：H7及其他致病性大肠杆菌都普遍存在。

在所有的致病性大肠杆菌中，以肠出血性大肠杆菌O157：H7的毒力最强，也最受人们关注，因此本研究对其进行单独的分离鉴定。从屠宰场及外环境等样品中共分离到大肠杆菌O157：H778株，阳性率为11.2%，其中屠宰场阳性率最高，为16.2%；污水中阳性率最低，为5.2%。近几年来，我们对大肠杆菌O157：H7一直都有监测。黄育浩等使用荧光PCR的方法对东莞市屠宰猪O157：H7污染情况进行调查，2007-2009年平均阳性率23.61%［2］。曾毅等对南宁市2008-2012年大肠杆菌O157：H7进行监测，平均阳性率为0.38%［3］。倪大新等随后对江苏省大肠杆菌O157：H7在宿主动物中的带菌率及菌株毒力情况进行了检测，从6个监测点共采集猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便样本1 767份，共检出大肠杆菌O157：H7170株，总带菌率为9.62%［4］。与其他省市相比，东莞市的O157：H7的检出率一直偏高。一方面可能跟采样的环境有关，屠宰场环境狭小，在很短的时间内要屠宰大量的猪，可能会导致污染的情况发生；另一方面也说明东莞市的大肠杆菌O157：H7有暴发流行的危险。

除肠出血性大肠杆菌O157：H7外，其他的致病性大肠杆菌也都普遍存在于屠宰猪体内及外环境中。本试验共分离到其他致病性大肠杆菌70株，其中肠产毒性大肠杆菌20株，肠道致病性大肠杆菌42株，肠侵袭性大肠杆菌8株。以血清型O138、O9、O8为主要流行株，占所有菌株的45.5%。大肠杆菌血清型众多，不仅不同地区有不同的优势菌株，而且同一地区在不同的时间也会有不同的优势菌株。赵恒章等对豫北地区的致病性大肠杆菌进行分离鉴定，其主要流行血清型为O101，O60，O141［5］，O139。姜卫东等报道，O119、O60、O75、O141、O20、O8为广东省猪大肠杆菌流行的优势血清型［6］。10年后，苏丹萍等对广东地区部分猪场的致病性大肠杆菌进行分离鉴定，发现O138、O9为优势血清型。占分离菌株的37.93%［7］。高云英等报道，陕西省猪大肠杆菌流行的优势血清型为O139、O101、O149、O141、O60［8］。由此可见地区间致病性大肠杆菌血清型分布差异较大，需要定期对该细菌进行监测，掌握流行情况。

我们先通过荧光PCR的方法进行初步筛选，阳性样品进行下一步分离鉴定，并最终根据细菌分离鉴定确定结果。荧光PCR的阳性率比细菌分离鉴定的阳性率要高，这跟其方法的特点有关。荧光PCR技术以其快速、敏感的特点在临床上广泛应用，但高敏感性也使其有假阳性的风险。细菌分离鉴定虽然耗时长，工作量大，但是假阳性较少。我们将这两种方法结合，既减少工作量，又提高了工作效率。

致病性大肠杆菌是一种人畜共患病病原菌，可通过污染的食物和水等引起暴发流行。本次调查结果表明，屠宰猪及屠宰场的环境、污水、场地和器具都受到不同程度的污染，防控形势严峻。本试验的结果为监管部门研究进一步的防控措施、制定用药方案奠定了基础。

参考文献：

［1］2011年O104:H4型大肠杆菌疫情［EM/BL］.http://zh.wikipedia. org.2011-07-06.

［2］黄育浩，谢国怀，黄炳炽，等.肉类大肠杆菌O157：H7污染情况调查［J］.黑龙江畜牧兽医，2011（2）：119-120.

［3］曾毅，林建燕，黄世美，等.2008-2012年南宁市肠出血性大肠杆菌O157：H7监测结果［J］.职业与健康，2013，29（14）：1748-1749.

［4］倪大新，汪华，顾玲.江苏省1999年大肠埃希氏O157：H7宿主动物带菌情况调查［J］.中华流行病学杂志，2002，23（2）：102-104.

［5］赵恒章，赵坤，余燕.豫北致病性猪大肠杆菌分离鉴定［J］.河南科技学院学报，2008，36（2）：76-79.

［6］姜卫东，黄引贤.广东省仔猪腹泻大肠杆菌血清型鉴定［J］.中国兽医学报，1998，18（1）：64-66.

［7］苏丹萍，赵彦宗，陈敏鸿，等.广东地区部分猪场大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.畜牧与兽医，2010，42（7）：80-82.

［8］高云英，李浩波，李琳，等.陕西仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性测定［J］.中国农学通报，2005，21（9）：12-15.

中图分类号：S852.61

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0101- 03

收稿日期：2014-05-15

基金项目：东莞市科技计划项目（2012108102053）

作者简介：徐振娜（1987-），女，助理兽医师，硕士，研究方向为动物传染病防治，E-mail：57995344@qq.com