瓜类枯萎病研究进展

王卿 林玲

摘要：枯萎病又称蔓割病、萎凋病，是瓜类作物上最主要的病害之一，一直是国内外研究的热点。该病是由尖孢镰刀菌侵染引起的一种土传、种传维管束病害，防治困难且病原菌具有寄主专化性，在全球大部分的瓜类产区均有发生，给我国及世界各国的农业生产造成了巨大的经济损失。本文结合最新的研究内容，对瓜类枯萎病病原菌寄主专化型、病原菌全基因组测序与致病机制、病原菌分子检测、寄主抗病分子机制以及病害防治措施进行了概述，并对今后的研究方向进行展望。

关键词：瓜类枯萎病；寄主转化型；致病机制；抗病机制；检测及防治措施

Research progress on Fusarium wilt of cucurbits

WANG Qing，LIN Ling

（Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China）

Abstract：Fusarium wilt caused by different formae speciales of the fungus Fusarium oxysporum is one of the main diseases on the Cucurbitaceae plant family. This soil-borne and seed-borne vasular disease is difficult to control. It occured in the cucurbit production areas around the world and caused enormous economy loss in China and other countries. This paper summarized the latest research progresses of the formae speciales， genome sequence，pathogenesis mechanism and molecu？ lar detection of the pathogen， molecular mechanism of disease resistance in cucurbits as well as the control methods of this disease，and the future research was also prospected.

Key words：Cucurbits Fusarium wilt；Formae speciales；Pathogenesis mechanism；Disease resistance；Detection and con？ trol method

瓜类枯萎病（Fusarium wilt）又称萎蔫病，是由不同专化型的尖孢镰刀菌引起的一种土传病害，主要危害西瓜、黄瓜、甜瓜、苦瓜等瓜类作物，该病在除南极洲以外的各大洲均有发生。目前，瓜类枯萎病在国内瓜类主栽区普遍发生，成为严重制约瓜类蔬菜产业发展的重要因素。不同瓜类枯萎病致病菌的生态学特征、侵染过程及防治方法很相似。尖孢镰刀菌不断进化出新的生理小种，并且其厚垣孢子能够长期在土壤中存活，使得枯萎病的防治十分困难[1]。本文根据国内外瓜类枯萎病的研究成果，对瓜类枯萎病病原菌的寄主专化型、全基因组测序、致病机制、分子检测技术，以及寄主抗病机制和病害防治方法进行了总结概述。

1病原菌寄主专化型

瓜类枯萎病主要由子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）丛赤壳科（Nectriaceae）镰孢菌属（Fusarium）的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起，瓜类枯萎病致病菌至少存在8个专化型[2]，分别为：尖孢镰刀菌西瓜专化型（F. oxysporum f. sp. niveum）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）、尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F. oxysporum f. sp. melonis）、尖孢镰刀菌丝瓜专化型（F. oxysporum f. sp. luffae）、尖孢镰刀菌葫芦专化型（F. oxysporum f. sp. lagenariae）、尖孢镰刀菌苦瓜专化型（F. oxysporum f. sp. momordicae）、尖孢镰刀菌冬瓜专化型（F. oxysporum f. sp. beninca？ sae）、尖孢镰刀菌瓜类专化型（F. oxysporum f. sp. cu？ curbitacearum）。这些不同专化型的尖孢镰刀菌在形态上没有明显差异，但是对同科不同属寄主植物的致病力不同。在同一专化型的尖孢镰刀菌中，又根据对寄主植物同属的不同品种致病力的差异，划分为许多生理小种。截至目前，国际报道的西瓜枯萎专化型有4个生理小种：0、1、2和3[3]；甜瓜枯萎专化型有4个生理小种，即生理小种0号、1号、2号和1.2号，根据生理小种1.2号引起病害症状的差异，又将其分为1.2w和1.2y[4]；黄瓜枯萎专化型划分为生理小种1号、2号、3号和4号[5]。

2病原菌全基因组测序与致病机制

2010年Ma等[6]完成了尖孢镰刀菌的基因组测序，这为从比较基因组、功能基因组、蛋白质组方面全面分析其致病性、致病因子等相关的信息提供了基础。该研究表明尖孢镰刀菌基因组的种系特异性（LS）序列包含4个同源染色体，占据了整个基因组的四分之一，LS区域富含转座子和与致病性有关且有进化痕迹的基因，通过共培养，使不同尖孢镰刀菌中2个LS染色体发生自发的水平转移，就可将一个非致病菌株转变为致病菌株，导致新的致病家族快速出现，这些发现为人们了解致病性的演化提供了线索。

一般来讲，尖孢镰刀菌致病需经过菌丝生长、侵染、定殖及扩展。瓜类作物最初的侵染来自土壤中越冬的厚垣孢子，厚垣孢子萌发产生侵染性的菌丝，菌丝可侵染寄主根部尤其是侧根或者受伤的根部，并在根部表皮细胞黏附、生长；接着，病原菌可穿过寄主根部皮层逐渐到达木质部维管束，产生更多的菌丝及分生孢子，并随蒸腾作用向上运动、阻塞维管束。整个侵染过程中，病原菌都要克服植物防御应答，在侵染的最后阶段，病原菌分泌细胞溶解酶和毒素，引起植物发病症状，包括坏死和萎蔫[7]。通过对病原菌进行绿色荧光蛋白GFP标记的方法，可研究病原菌在植物体内的侵染动态。Zvirin[8]等对甜瓜生理小种1.2进行GFP标记，研究了其在感病品种‘Ein Dor和抗病品种‘BIZ中的定殖动态，并发现病原菌对寄主侵染的速度与寄主的抗性有关，对感病品种的侵染速度明显快于抗病品种；另外，有研究表明，病原菌在植物体内定殖的数量与寄主的发病情况成正相关，对病原菌进行绿色荧光蛋白GFP标记并侵染寄主，发现植株中病原菌的荧光强度越强，其病害越严重[9]。

目前，人们对尖孢镰刀菌的致病因子进行了大量的分子生物学研究。甜瓜枯萎病菌中fow1编码线粒体载体蛋白的致病相关基因，与尖孢镰刀菌在宿主中的定殖密切相关，fow1缺失突变体不能在甜瓜组织中定殖从而减弱了对寄主的侵染能力[10]； fow2编码Zn（Ⅱ）2Cys6家族中一个锌指双核簇状DNA结合区，是病菌侵入甜瓜根部并在其组织内定殖的关键基因[11]。编码尖孢镰刀菌黄瓜专化型磷脂酶C的FoPLC4在调控病菌的分生孢子形成和致病性中发挥重要作用，在相同条件下，突变体？Fo？ PLC4不但可产生和野生型菌株一样的小型分生孢子，还可产生大型分生孢子，且产孢量下降了82.2 %；在致病力测定中，？FoPLC4与野生型相比，导致的黄瓜萎蔫症状明显减轻[12]。基因FoCdk8、FoCycc、Fomed19和Fomed10均参与调控西瓜枯萎病菌的生长发育、产孢、孢子萌发及致病性等方面，4个基因敲除的突变体菌丝受不同程度抑制，菌丝生长缓慢，孢子产量显著下降，分生孢子萌发缓慢，萌发率显著下降，致病力也不同程度下降甚至完全丧失[13]。

3病原菌的分子检测鉴定

枯萎病菌的早期检测及诊断对枯萎病的防治有着重要意义，然而传统的病原菌鉴定方法需观察植株发病症状、分离病原菌、鉴定寄主致病性，该方法耗时较长，灵敏度较低，经验性较强，不利于病害发生的有效控制。随着现代分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应（PCR）、巢式PCR（nested PCR）、实时定量PCR（Real-time PCR）以及限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA标记（RAPD）等技术可以用于快速准确的检测出病原菌，对病原菌进行早期预警诊断，有效地控制病原菌的传播与病害流行。张淑梅等[14]根据真菌核糖体转录间隔区（ITS）序列具有种内稳定性和种间高度变异性的特点，对黄瓜、西瓜和甜瓜枯萎病菌ITS序列设计了1对特异性引物，建立了瓜类枯萎病菌一步PCR分子检测体系，可在症状出现前约7 d检测到3种寄主枯萎病菌；该方法成本低、耗时短、污染小、实用性较强。Zhang等[15]根据镰刀菌属ITS区设计了特异性引物Fn-1和Fn-2，用常规PCR方法检测西瓜枯萎病菌时，基因组的灵敏度为1 fg，将该特异性引物联合通用引物（ITS1/ITS2）利用nested PCR检测西瓜枯萎病菌时，其灵敏度可提高1 000倍。PCR-RFLP、nested PCR、Real-time PCR的方法都可在瓜类没有明显症状时检测出中尖孢镰刀菌，都具有灵敏高、特异性强的特点。陈微等[16]利用PCR-RFLP和nested PCR2种方法检测黄瓜枯萎病菌，认为PCR-RFLP的灵敏度比nested PCR高，2种方法分别于接种病菌3 d和5 d时检测出黄瓜枯萎病菌，但nested PCR特异性更好，方法简便，更适合于黄瓜枯萎病菌的实际检测。Real-time PCR方法污染少、成本低、特异性和灵敏性较好，Kelly等[17]利用Real-time PCR可以准确鉴定并定量黄瓜枯萎病专化型菌株；赵爽等[18]应用基因宏阵列（Macroar？ ray）技术对土壤中尖孢镰刀菌进行快速监测，并应用Real-time PCR对发病土壤中西瓜枯萎病菌的数量进行了绝对定量。RAPD也是病原真菌检测中的重要分子方法，Lin等[19]利用RAPD分析，设计了特异性引物Fon-1/Fon-2和FnSc-1/FnSc-2，能够区分Fon和Fo，而且灵敏度较高，当Fon的DNA浓度低至0.01 pg时仍可检测到。Rubén[20]等基于由RAPD演化而来的特定序列扩增区段标记（SCAR）技术，建立了Real-time PCR的方法，可在甜瓜无明显症状时对甜瓜枯萎病菌进行检测和定量；利用该方法在病原菌接种48 h时就可将其检测到。

4寄主抗病分子机制

瓜类寄主对枯萎病菌侵染后的反应是全方位多方面的，寄主在胁迫条件下的整体反应表现为初级代谢的改变，受到病原菌侵染后会开启和增强自身抗性相关基因的表达，并形成与抗病相关的产物，从而表现出不同程度的抗病性和免疫性[21]。

黄瓜的基因组已被测序，在黄瓜抗枯萎病相关基因研究上，用比较基因组学的方法分析抗病基因同源序列（RGA）与已定位抗病基因的关系，为新抗病基因的发现提供了捷径。沈凤瑞等[22]以黄瓜抗枯萎病材料‘Cu14为试材，采用基因差异显示技术（DDRT-PCR）研究了黄瓜枯萎病抗性相关基因，获得差异片段A178-2，通过BLAST比对发现该基因片段的328个核苷酸中有145个核苷酸与拟南芥泛素蛋白同源，可能与胁迫反应、免疫应答等有关。西瓜抗枯萎病基因方面的研究还相对比较缓慢，西瓜种质‘PI296341根部组织全长cDNA库的建立，为新的西瓜枯萎病抗病基因的筛选和克隆提供了条件；对西瓜进行枯萎病菌接种，并用实时定量PCR监测，结果显示接种西瓜12 h后基因ClWRKY1表达达到最大量[23]。吕桂云等[24]构建了枯萎病菌诱导的西瓜根系组织抑制性差减杂交cDNA（SSH-cDNA）文库，并对其中高质量的表达序列标签（EST）序列进行分析，初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中的基因表达信息，为克隆西瓜与枯萎病互作中的相关重要基因的克隆和功能分析奠定了基础。Lü等[25]初步利用Agilent自定义基因芯片，分析了西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录情况，发现在接种病菌后不同时间段中，西瓜根部基因差异表达显著。甜瓜抗枯萎病基因克隆的研究取得了突破性进展，目前，在甜瓜上分离鉴定了4个抗枯萎病基因，分别是Fom-1、Fom-2、Fom-3以及隐性基因fom-4[7]。Brotaman[26]对Fom-2转录间隔区进行序列分析，发现了2个抗病候选基因，并推测Fom-2基因编码1个核苷酸结合位点-亮氨酸富集重复（NBS-LRR）型抗病蛋白，NBS-LRR类抗性基因是迄今从植物中克隆到的最大一类抗病基因。Luo等[27]以甜瓜抗枯萎病品系‘MR-1为材料，构建了2个甜瓜细菌人工染色体（BAC）文库，并用与Fom-2共分离的FM和AM基因标记作为探针筛选候选抗病基因，研究表明，抗病基因通常以基因簇的形式存在。

5病害防治方法

瓜类枯萎病为土传病害，防治困难，生产中采用选育抗病品种、农业防治、化学防治及生物防治等多种方法。但是目前各种防治方法对该病均具有局限性，因地制宜开展综合防治才是行之有效的防治方法。

5.1选育抗病品种

选育抗病品种是防治西瓜枯萎病最经济、有效的方法。国内主栽的18个甜瓜品种中，高抗枯萎病的品种有‘新金雪莲‘长香玉‘春辉‘玉姑‘蜜绿5个品种[28]；黄瓜抗枯萎病品种有‘华优1号‘津杂2号‘津杂3号‘中农3号‘中农5号‘龙杂黄3号‘津优49号[29]等；西瓜抗枯萎病品种有‘郑抗2号‘京抗2号‘京抗3号‘西农8号‘早冠龙等。抗病品种的应用与推广，减少了农药的使用与污染，获得了显著的经济效益。但抗病育种选育时间长、耗资高，随着病原菌不断分化，抗病品种的抗性具有局限性，因此需要不断培育筛选出具有广谱抗性的品种。

目前，分子标记作为一种辅助手段应用于瓜类抗枯萎病育种中，研究较多的是与抗病基因相关的分子标记。许勇等[30]将与枯萎病抗性基因连锁的RAPD标记转化为SCAR标记，简化了SCAR扩增产物的检测技术，并初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。羊杏平等[31]采用相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术，对35份西瓜核心种质资源进行了多态性分析，为西瓜抗病新品种选育和分子辅助育种奠定了基础。Wang等[32]研究表明，共显性标记的45个不同地理来源的甜瓜基因型表现出片段大小和抗性表型的高度相关性，这些标记在分子辅助育种方面可能发挥作用。

5.2嫁接防治

嫁接技术的应用和发展使瓜类枯萎病在很大程度上得到了的控制[33]。其防病原理主要是利用病原菌具有寄主专化性且从寄主植物根部侵入的特性，重点寻找合适的砧木，将瓜类作物嫁接至非此瓜类枯萎病菌专化型寄主的砧木上，不但能有效地防治病害，还能增加产量、延长收获期。西瓜主要嫁接砧木为种间杂交南瓜和小葫芦[34-35]。西葫芦、丝瓜和冬瓜等作为砧木对西瓜枯萎病也有一定的抗性，但西葫芦影响西瓜的产量和品质，可能是由西葫芦与西瓜的亲和性问题引起的。利用‘Sheng？ yan Tianzhen（SYTZ）和‘南砧1号（NZ1）的南瓜砧木嫁接甜瓜，可有效抑制甜瓜枯萎病的发生，并提高甜瓜的产量和品质，增加类胡萝卜素含量[36]。以‘黑籽南瓜‘锦栗南瓜‘早青西葫芦和‘杭州长蒲作砧木，高山黄瓜‘津优5号为接穗，发现嫁接苗抗病性明显提高，其中‘黑籽南瓜为最佳砧木[37]。采用砧木嫁接，有时造成瓜类的品质下降，嫁接技术难度高、工作量大、后期管理较繁琐。因此，选择砧木时，要综合考虑抗病性、丰产性及对瓜类品质的影响等因素。

5.3轮作与间作

尖孢镰刀菌的厚垣孢子可在土壤中存活10 a（年）以上，合理轮作是防治枯萎病最早使用的方法。寄主瓜类作物根部分泌物可刺激尖孢镰刀菌萌发并形成孢子，而非寄主作物根部分泌物不能刺激尖孢镰刀菌萌发，因此瓜类作物与非寄主作物轮作，可抑制枯萎病的发生。Wu等[38]检测了连续5 a种植西瓜后休耕3 a的土壤中微生物含量，发现休耕3 a间土壤中西瓜枯萎病菌含量分别降低20%、40%和50%，并且其他镰孢属菌的含量也下降。目前，对于轮作的研究由于其耗时太久而较为困难，但研究轮作对病原菌的影响对枯萎病的防治有重要意义。

另外，植物普遍具有化感作用，可通过挥发、分泌和分解等方式向环境释放某些化学物质而影响周围植物的生长和发育。Wu等[39]研究发现腐烂的感病品种的西瓜提取物中含有较多刺激西瓜枯萎病菌生长的酚酸，而腐烂的抗病品种的西瓜提取物中含有较多抑制西瓜枯萎病菌生长的酚酸，表明腐烂西瓜植株残留在土壤中的酚酸可以促进或抑制病原菌的生长。杨瑞秀等[40]从甜瓜根系分泌物检测到没食子酸、邻苯二甲酸、丁香酸、水杨酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸7种酚酸物质，其中阿魏酸、苯甲酸、肉桂酸在0.1、0.25 mmol·L-1处理浓度下能够显著促进尖孢镰刀菌的孢子萌发。因此合理实施轮作，可有效减少瓜类连作导致的酚酸物质和病原菌的增加，减少病害的发生。此外，大蒜根系分泌物[41]及水稻[42]、西芹挥发物[43]等也会对瓜类枯萎病产生不同程度的抑制作用。这些研究为瓜类轮作、间作及套作植物的选择提供了参考。

5.4化学防治

化学防治瓜类枯萎病的报道很多。丙硫菌唑、甲基托布津、醚菌酯、多菌灵、嘧菌酯、嘧霉胺、甲基硫菌灵等能有效防治瓜类枯萎病[44-46]。利用棉隆、异氰尿酸、含氯药剂进行土壤消毒处理，能够有效降低土壤中枯萎病菌的基数，减轻病害发生[47]。然而长期使用化学药剂易造成农药残留和环境污染，不仅危害人畜健康，而且易使病菌产生抗药性，防效逐渐降低。而且瓜类枯萎病为土传病害，很难实行大面积的土壤药剂处理。

5.5生物防治

生物防治主要采用具有拮抗作用的真菌、细菌、放线菌等拮抗菌以及植物源活性物质、生防微生物之间或与有机肥料进行混合等方法，由于其环境友好型的特点，在有机农场中有较好的应用前景。目前研究较多的拮抗菌有链霉菌[48]、芽孢杆菌[49]、非致病尖孢镰刀菌[50]、哈茨木霉[51]等。很多报道表明，拮抗菌与成熟堆肥混合使用时的防效比单独使用拮抗菌的防效高[52]。拮抗放线菌CT205对黄瓜枯萎病防治效果为51.85%，当与有机肥复配时，防治效果达81.85%[53]。将多黏类芽孢杆菌SQR21制成生物有机肥（BIO）处理被西瓜枯萎病侵染的土壤，并利用实时荧光定量PCR及DNA阵列快速检测土壤中的病原菌，结果表明，BIO处理过后根围土壤中枯萎病菌从8.65×104cfu·g-1下降到9.41×103cfu·g-1[54]。另外，有研究表明，一些拮抗菌株在特定的条件下可产生特定的有机挥发性物质（VOCs），能够抑制一些病原菌菌丝生长及孢子萌发、抑制真菌的基因表达[55]、促进植物生长、引发植物系统抗性[56]。W G Dilantha Fernando等[57]首次对细菌产生的VOCs进行鉴定并将其应用于生物防治。目前，对VOCs的研究大多集中在其功能及机制方面，对其应用的研究还较少。多种植物的活性成分对瓜类枯萎病具有抑制作用，利用天然植物提取物的抑菌作用来防治瓜类枯萎病，也是近年来的研究热点，但植物的选择及其活性物质的商品化还需长期探索。

6展望

瓜类枯萎病对瓜类生产造成了严重的危害，枯萎病菌生理小种的鉴定有利于瓜类栽培品种的选择，然而对生理小种的鉴定还比较困难。目前，病原菌抗性遗传规律的不确定性，使抗病品种的培育成为育种的一大难题，新品种的选育可采用传统育种与细胞工程、基因工程等相结合的方法，缩短育种周期来满足市场需求；对枯萎病的防治方法中，化学防治易造成药剂残留、病原菌产生抗药性等问题；生物防治见效较慢，且常以活菌作为生防制剂，易受环境影响，因此需选择生态适应性较强的生防菌，同时也可将生防菌与适宜有机肥料复配，减轻生防菌生态压力，在提高瓜类枯萎病防效的同时达到增产的目的。虽然生物有机肥产品可抑制枯萎病的发生，但是由于生物有机体在环境中的稳定性较低，并有偶尔失效的现象，因此其商业使用率仍然很低。

尖孢镰刀菌的分子生物学研究起步较晚，尤其是国内尚处于对单个致病基因功能的研究水平。随着尖孢镰刀菌基因组测序的完成，越来越多的致病相关基因将被发现，其致病机制也会更加明了。利用新一代的测序技术进行瓜类作物的基因组学研究，将成为瓜类作物的主要研究方向。探索定向改造引起瓜类感病性状形成的靶基因，对提高瓜类作物抗病性、开发长久有效防治枯萎病的新技术和新策略将具有十分重要的意义。

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