体外酶法水解制备小分子透明质酸

原攀红， 康 振， 金 鹏， 刘 龙，*， 堵国成，2， 陈 坚，2

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

体外酶法水解制备小分子透明质酸

原攀红1， 康 振1， 金 鹏1， 刘 龙1，*， 堵国成1，2， 陈 坚1，2

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

为了制备分子量分布集中的小分子透明质酸，在6 g/ L的高分子量透明质酸水溶液中加入一定梯度重组水蛭透明质酸酶，并控制水解时间。结果表明，通过控制加入重组水蛭HAase的量和水解时间，根据水解分子量下降规律，可以制备出分子量分布集中的小分子HA，包括水解终产物透明质酸四糖和六糖。同时，通过高效体积排阻色谱和琼脂糖凝胶电泳，可以证明水解产物的分子量分布集中。

透明质酸；重组水蛭透明质酸酶；小分子透明质酸；高效体积排阻色谱；琼脂糖凝胶电泳中图分类号：TS202.1 文献标志码：A

透明质酸（hyaluronan或hyaluronic acid，HA），俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β（1-3）和β（1-4）糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏多糖［1-3］，1934年由Meyer等人首次从牛玻璃球眼中提取获得，广泛应用于医药、化妆品、食品等领域。

HA以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。由于HA具有良好的保湿性、黏弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛地应用于化妆品、食品和医药等领域［4］。分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能［5-7］。高分子量的HA（相对分子质量＞2×106u）由于具有较好的润滑、抑制炎性反应、保湿等功能，可应用在眼科手术黏弹剂、关节腔内注射治疗药物和高端化妆品之中。中等分子量的HA（介于1× 105～106）具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连等药物中。低分子量的HA和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用［8-10］，且易于渗透到真皮中，是免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，水解制备小分子HA在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

制备小分子HA的方法有物理降解法、化学降解法、酶解法［11］。物理法主要为加热、机械剪切、紫外辐射、超声波破碎、60Co照射、γ-射线辐射，可促使HA发生降解。物理降解法处理过程简单，产品易于回收。但是，这些方法都存在一定的缺陷，例如加热法易使HA变色，紫外和超声效率较低，且产生的小分子HA分子量范围较大，产品稳定性差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解（HCl）和碱水解（NaOH），氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠（NaClO）和过氧化氢（H2O2）。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给HA性质带来影响和给产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。酶解法是HA在酶的作用下，HA链上的糖苷键发生断裂，产生小分子透明质酸。但是，多数酶解效率不高，在缓冲液中进行，水解产物含有较多杂质，且产生的小分子透明质酸分子量分布不集中［12］。本研究中，重组水蛭透明质酸酶（hyalurondiase，HAase）水解HA，反应条件温和、专一性强，不在缓冲溶液中溶解透明质酸，水解产生的小分子透明质酸不含无机盐等杂质。通过控制重组水蛭HAase的量和水解时间，可以成功获得分子量分布集中且纯度较高小分子HA。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葡聚糖标准样品（180，2 700，9 750，13 050，36 800，135350，2000000 u）购于中国食品药品检定研究院，用于制作标准曲线。

透明质酸酶P. pastoris GS115-HAase由本实验室构建，其特性以P. pastoris GS115为宿主，整合来自水蛭的透明质酸酶基因（GenBank登录号KJ026763），同时具有His +和Mut +表型，发酵产生重组水蛭透明质酸酶。取所需量的发酵液在4℃、12 000 r/ min条件下离心30 min，上清液即为实验水解反应所需的重组水蛭HAase，以HA为底物测定重组水蛭HAase活力，重组水蛭HAase活力测定方法采取DNS法［13-16］，最高酶活8. 42×105U/ mL［17］，根据所测酶活，计算出加入反应体系的重组水蛭HAase体积。

1.2 仪器和设备

DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；DKB-600A型电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司；台式高速离心机，德国Eppendorf公司；GelDoc凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司；1260型液相色谱，安捷伦科技有限公司；Ultrafle Xtreme型基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪，美国布鲁克公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分析透明质酸水解过程

将60 mg大分子HA加入10 mL纯水中，配制成为反应底物溶液，加入重组水蛭HAase（1×104，5× 104，1×105U/ mL），在45℃最适条件下水解，每隔1 h取一次样，样品取出后立即水煮灭活，12 000 r/ min离心5 min，上清液通过0. 22 μm的滤膜除去杂质。

1.3.2 高效体积排阻色谱测分子量大小及分布

用高效体积排阻色谱系统（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）分析分子量分布［18］。HPSEC体系是一套安捷伦1260系统，由G1310A泵和G1329B针头和G1362A示差检测器组成。分析条件为色谱柱Ultrahydrogel™Linear column 7. 8 mm×300 mm；流动相0. 1 mol/ L NaNO3溶液；流速0. 9 mL/ min；柱温40℃；进样量40 μL。根据葡聚糖标准样品的洗脱体积，使用凝胶渗透色谱分析法（gel permeation chromatography，GPC）制作出分子量和洗脱体积之间的标准曲线。在相同的条件下，测出每个样品的洗脱体积，GPC可计算出每个样品的重均分子量、数均分子量及分子量分布。

1.3.3 一定分子量透明质酸的制备

根据透明质酸水解规律曲线，在特定时间点高温将酶失活，终止反应，即可制备一定分子量的透明质酸，将样品在-80℃冷冻，之后放入冷冻干燥机中冻干至粉末状。

1.3.4 MALDI-TOF MS检测终产物

基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）用来检测水解产物［19］。将样品和2，5-二羟基苯甲酸各1 μL混匀点靶，吹干后，在氮气激光波长337 nm加速电压20 kV和负离子模式下进行质谱分析。使用Flex Control控制软件和Flex Analysis versison 3. 3分析软件。

1.3.5 琼脂糖电泳检测产物的分子量分布

称取2 nmol样品，加入5 μL ANTS溶液在室温下放置15 min，再加入5 μL氰基硼氢化钠，在37℃条件下放置16 h［20］。反应后，将样品在4℃，10 000 r/ min条件下离心10 min。取5 μL上清液点入3%的琼脂糖凝胶孔中，在TBE缓冲液中，80 V电压下电泳40 min。电泳后，琼脂糖胶在365 nm的紫外灯下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 HA的水解过程分析

2.1.1 水解过程中pH值的变化

为检测pH值的变化规律，每隔1 h使用pH计测量反应溶液中的pH值，如图1。

由图1，3种酶活条件下pH值都没有发生太大变化，保持在6. 0左右，且接近重组水蛭HAase的最适pH值6. 5。因此，重组水蛭HAase作用于HA无需在醋酸盐缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸缓冲液中进行。从而实现了反应操作简便化，达到产物纯净不含盐杂质的目的。

2.1.2 水解过程中酶活的变化

为了检测反应过程中酶在水中活性的变化，前2个小时，每个半小时取一次样，之后每2个小时取一次样。使用DNS法测定酶活，绘制酶活变化曲线图2。

图1 不同酶活条件下pH值变化趋势Fig. 1 pH changing trend under conditions of different HAase activity

图2 水中酶活的变化趋势Fig. 2 HAase activity changing trend in water

由图2发现酶活在一定范围内波动，直到16 h，酶活仍然很高，为反应持续进行提供保障。

2.1.3 水解过程中分子量变化规律

使用HPLC-SEC-RI方法测定不同酶量（1× 104，5×104，1×105U/ mL）不同时间点水解产物的分子量，如图3。

由图3可知，水解15 h的分子量变化曲线图。可以发现，初始反应速率极大，分子量迅速降低，且酶活越高，分子量降低速率越快，随后反应速率逐渐降低，直至分子量几乎不发生变化，且酶量越高，分子量越早不发生变化，分子量最终停滞在较低水平。可见，单位体积的酶量越高，链断裂的越快，且断裂的越彻底。因此，制备聚合度不同透明质酸，需要控制HAase的量和水解时间。

图3 不同酶活条件下分子量变化趋势Fig. 3 Molecular weight changing trend under the conditions of different HAase activity

2.2 特定分子量透明质酸的质量分布

根据水解过程中分子量变化曲线图，通过控制加入的酶量和水解时间，可以制备出一定分子量的透明质酸。加入酶量104U/ mL的条件下，水解40 min后高温煮沸将酶灭活，终止整个反应，样品冻干后使用HPLC-SEC-RI方法测得透明质酸分子量，见图4，由图4可知，透明质酸分子质量大小为6 000 u，分子量分布系数为1. 45。

图4 分子质量为6 000 u的质量分布图Fig. 4 Mass distribution of molecular mass 6 000 u

酶量5×104U/ mL的条件下，在40 min终止反应，使用HPLC-SEC-RI方法测得分子量，见图5。

由图5可知，分子质量大小为3 000 u的小分子透明质酸，分子量分布系数1. 09。根据水解产物的分布系数可以看出，通过这种方法可以制备出分子量分布集中的小分子透明质酸。

2.3 水解终产物的鉴定

MALDI-TOF MS可以准确灵敏的检测出糖类样品的分子量信息。反应体系中加入酶量1×105U/ mL，水解10 min终止反应，样品冻干后使用MALDI-TOF MS检测，发现水解产物分子质量有797. 192 0， 1 176. 282 0，1 555. 389 0，1 934. 51.2.u，分别是HA4，HA6，HA8，HA10的带电粒子，如图6；水解1 h终止反应，检测发现水解产物分子质量有797. 192 0 u和1 176. 282 0 u，是HA4，HA6带电粒子。除基质（基质DHB中含NaCl）产生的峰外，不含其他大分子透明质酸，如图7。随着水解时间延长，分子质量不再发生变化（如图3），经检测，15 h产物仍由透明质酸四糖HA4和透明质酸六糖HA6组成（如图8），说明透明质酸四糖HA4和透明质酸六糖HA6是水解终产物。相比于其他水解酶，终产物仅有两种，有利于实现HA4和HA6的大量生产和制备。

图5 分子质量为3 000 u的质量分布图Fig. 5 Mass distribution of molecular mass 3 000 u

图6 水解中间产物的MALDI-TOF MS分析Fig. 6 MALDI-TOF MS analysis of hydrolysis of intermediate product

2.4 琼脂糖凝胶电泳检测产物

为了直观显示水解产物分子量分布情况，使用琼脂糖凝胶电泳的方法对水解产物进行分析，将制备出的分子质量大小为6 000，4 000，3 000 u HA片段及终产物染色后，在3%的琼脂糖凝胶中电泳，结果如图9。1代表分子质量大小6 000 u，2代表分子质量大小4 000 u，3代表分子量大小3 000 u，4代表终产物。可见，每种样品的电泳结果仅有一个条带，说明水解产物分子量分布相对集中。与其他透明质酸酶的水解产物相比，具有一定的优势，且带不宽。说明重组水蛭HAase专一性强，可使用重组水蛭HAase水解HA制备分子量分布集中的HA片段。

图7 水解终产物的MALDI-TOF MS分析Fig. 7 MALDI-TOF MS analysis of hydrolysis of end product

图8 水解终产物的ESI-MS分析Fig. 8 ESI-MS analysis of hydrolysis of end product

图9 不同分子质量HA片段的琼脂糖电泳分析Fig. 9 Agarose electrophoresis analysis of different molecular weight hyaluronan

3 结 论

本研究发现重组水蛭HAase降解高分子HA可以在水溶液中进行。水解结果显示单位质量的HA对应的HAase的量、水解时间对水解产物具有重要的影响。通过控制HAase的量、水解时间来获得分子量分布集中的小分子HA。与动物体内提取的透明质酸酶降解产物相比，本研究结果水解产物种类少，分子量分布集中，且不含无机盐等杂志。因此，对于制备分子量分布集中的小分子HA和终产物HA4和HA6具有重要的意义，将会促进相关领域的研究。对于潜在应用领域，包括化学合成、药物治疗、化妆品和保健食品领域等，将会产生重大的影响。为了实现研究的价值，实现工业化生产和得到更广泛的应用，将进一步扩大反应体系和优化水解过程，制备出高纯度的小分子透明质酸。

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Preparation of Small Molecular Hyaluronan by Enzymatic Hydrolysis in Vitro

YUAN Panhong1， KANG Zhen1， JIN Peng1， LIU Long1，*， DU Guocheng1，2， CHEN Jian1，2
（1. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to get concentrated distribution of small molecular hyaluronan，6 g/ L of high molecular hyaluronic acid aqueous solution was prepared，added with a certain gradient of hyaluronidase，and controlling the hydrolysis time. The results showed that controlling the amount of hyaluronidase and hydrolysis time，particular molecular weight hyaluronic acid could be prepared according to the law of the hyaluronan molecular weight decreased，which included tetrasaccharide and hexasaccharide. Furthermore，through high performance size exclusion chromatography and agarose gel electrophoresis，we could prove that the molecular weight distribution of hydrolysate was concentrated.

hyaluronan；recombinant leech hyaluronidase；small molecular hyaluronan；high performance size exclusion chromatography；agarose gel electrophoresis

李 宁）

10. 3969/ j. issn. 2095-6002. 2016. 02. 008

2095-6002（2016）02-0051-05

原攀红，康振，金鹏，等.体外酶法水解制备小分子透明质酸［J］.食品科学技术学报，2016，34（2）:51-55.

YUAN Panhong，KANG Zhen，JIN Peng，et al. Preparation of small molecular hyaluronan by enzymatic hydrolysis in vitro［J］. Journal of Food Science and Technology，2016，34（2）:51-55.

2015-04-03

原攀红，女，硕士研究生，研究方向为体外酶法水解制备小分子透明质酸；

*刘 龙，男，教授，博士，主要从事发酵过程优化方面的研究。通信作者。